วันอาทิตย์ที่ 24 กรกฎาคม พ.ศ. 2554

-ประโยชน์การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

ประโยชน์การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

       ปัจจุบันนี้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีบทบาทอย่างมากทั้งในด้านการเกษตรกรรม อุตสาหกรรม และด้านการแพทย์ ด้วยเหตุนี้จึงขอกล่าวถึงประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเป็นข้อ ๆ ดังนี้

เพื่อการขยายพันธุ์

โดยอาศัยอาหารสูตรที่สามารถเพิ่มจำนวนต้นเป็นทวีคูณจากไดอะแกรมประกอบ จะเห็นว่าจากที่เราเริ่มต้นทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อต้นพืชเพียงต้นเดียว และทำการย้ายเนื้อเยื่อเดือนละครั้ง และแต่ละเดือนต้นพืชสามารถเพิ่มจำนวนต้นได้ 10 ต้น เมื่อเวลาผ่านไปเพียง 6 เดือน เราสามารถผลิตต้นพืชในหลอดทดลองได้ถึง 1 ล้านต้น ซึ่งไม่มีวิธีอื่นใดที่จะ ผลิตต้นกล้าพืชให้ได้ปริมาณมากและรวดเร็วเช่นนี้

เพื่อการปรับปรุงพันธุ์

ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สามารถคัดเลือกสายพันธุ์พืช เพื่อการผลิตพืชพันธุ์ต้านทาน (resistant plant) สามารถที่จะชักนำให้เกิดความต้านทานขึ้นในต้นพืช โดยการเพาะเลี้ยงในอาหารที่มีเงื่อนไขต่าง ๆ เช่น การสร้างพันธุ์ต้านทานต่อสารพิษของโรค ต้านทานต่อแมลง หรือต้านทานต่อยากำจัดวัชพืช เป็นต้น หรือเพื่อการผลิตพืชพันธุ์ทนทาน (tolerance plant) ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสามารถที่จะคัดสายพันธุ์ทนทานได้จากการจัด เงื่อนไขของอาหารและสภาวะแวดล้อม เช่น การคัดเลือกสายพันธุ์พืชทนเค็มจากการเลี้ยงเนื้อเยื่อในอาหารที่มีส่วนผสม ของเกลือ การคัดเลือกสายพันธุ์ทนต่อดินเปรี้ยวจากการเลี้ยงในอาหารที่มีสภาพเป็นกรด การคัดสายพันธุ์ที่ทนร้อนโดยการเพาะเลี้ยงในสภาพที่มีอุณหภูมิสูง เป็นต้น
โดยการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ แล้วคัดเลือกเอาสายพันธุ์ดีไว้ ซึ่งอาจทำได้โดยการใช้สารเคมี การฉายรังสี การตัดต่อยีนส์ (DNA ricombination) และการย้ายยีนส์ (gene transformation) ยังเปิดโอกาศให้สามารถใช้ประโยชน์ในการสร้างพืชสายพันธุ์ใหม่ (transgenic plants) ที่ต้องการในพืชบางชนิด
เพื่อการผลิตพืชที่ปราศเชื้อไวรัส (Virus-free plant propagation)
ปัญหาสำคัญประการหนึ่งของการผลิตพืช คือ โรค ซึ่งอาจมีสาเหตุมาจากเชื้อรา แบคทีเรีย หรือไวรัส ต้นพืชที่ผลิตได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะปราศจากเชื้อราและแบคทีเรีย เป็นอันดับแรก เพราะถ้าหากว่ามีอนุภาคของเชื้อเหล่านั้นตกลงไปในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ ก็จะแสดงอาการปนเปื้อนของเชื้อ (contamination) เพราะทั้งอนุภาคของแบคทีเรียและสปอร์ของราสามารถเจริญเติบโตได้อย่างรวด เร็วบนอาหารและจะปรากฎกลุ่ม colony ของจุลินทรีย์เหล่านั้น ที่สังเกตเห็นได้ด้วยตาเปล่า เราจึงสามารถเก็บออกมาขจัดทิ้งได้ ส่วนในกรณีของการปนเปื้อนของเชื้อไวรัส ซึ่งเป็นอนุภาคที่มีขนาดเล็กมาก และจะสามารถดำรงชีวิตอยู่ได้ก็ต่อเมื่ออาศัยอยู่ในเซลล์ชนิดอื่น ฉะนั้นต้นพืชที่มีการปนเปื้อนของเชื้อไวรัสจึงไม่แสดงอาการปนเปื้อนให้เห็น สามารถทราบได้ก็ต่อเมื่อเกิดอาการบนต้นพืช ดังนั้นก่อนทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะต้องคัดเลือกและตรวจสอบเนื้อเยื่อ ชิ้นส่วนของพืชที่นับว่ามีความปลอดจากเชื้อไวรัสมากที่สุด คือ apical meristem ซึ่งเป็นเนื้อเยื่อเจริญที่อยู่บริเวณปลายยอดของลำต้น และเนื้อเยื่อของคัพภะ (embryo) ที่อยู่ในเมล็ด อันเนื่องจากอนุภาคของไวรัสสามารถเคลื่อนย้ายได้ทางท่ออาหาร (phloem) และ ท่อน้ำ (xylem) แต่เนื้อเยื่อดังกล่าวไม่มีท่อน้ำและท่ออาหารที่จะติดต่อกับ ส่วนอื่น ๆ ของต้นพืช

เพื่อการผลิตสารทุติยภูมิ (Secondary metabolite)
พืชบางชนิดสามารถให้สารที่มีคุณสมบัติทางยา หรือมีประโยชน์ทางด้านอุตสาหกรรม แต่ในบางครั้งปริมาณเนื้อสารที่ต้องการมีอยู่ในปริมาณน้อยมาก จะต้องใช้ชิ้นส่วนพืชจำนวนมากนำมาสกัดแยก การเพาะเลี้ยงเซลล์หรือเนื้อเยื่อของพืชเหล่านั้น ในสภาพแวดล้อมและอาหารที่เหมาะสมก็อาจชักนำให้เกิดการสังเคราะห์สารที่เรา ต้องการได้มากขึ้น
เพื่อการศึกษาทางชีวเคมีและสรีรวิทยาของพืช (Biochemical and Physiology study)
ต้นพืชที่เลี้ยงในหลอดทดลองนั้นสามารถที่จะติดตามการพัฒนาและเปลี่ยนแปลงได้ง่ายและอย่างใกล้ชนิด เช่น การศึกษาการตอบสนองของเนื้อเยื่อพืชต่อยาฆ่าแมลง ยาปราบศัตรูพืช หรือต่อสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช และการควบคุมตัวแปรต่าง ๆ ในหลอดทดลองทำได้ง่ายได้กว่าแปลงทดลอง
เพื่อการเก็บรักษาพันธุ์พืช (Germplasm conservation, gene bank)
ปัจจุบันพืชพรรณหลายชนิดได้สูญพันธุ์ไปหรือกำลังจะสูญพันธุ์ไปอย่างน่าเป็นห่วง ซึ่งอาจมีสาเหตุมาจากการเปลี่ยนแปลงของสภาวะแวดล้อมหรือเกิดจากการทำลายของมนุษย์เอง ด้วยเหตุนี้นักเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจึงได้พยายามคิดหาวิธีที่จะเก็บรักษาพืชพรรณต่าง ๆ ไว้ในหลอดทดลอง โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อในอาหารที่มีส่วนผสมของสารชะลอการเจริญเติบโตบางชนิด หรือมีสารที่ทำให้เกิดความเครียดของน้ำขึ้นในหลอดทดลอง ทำให้พืชมีการเจริญเติบโตในอัตราที่ช้ามาก ๆ เพื่อเป็นการประหยัดแรงงาน เวลา และอาหารในการที่จะต้องทำการย้ายเนื้อเยื่อบ่อย ๆ จนกว่าเมื่อใดที่ต้องการจะเพิ่มปริมาณเนื้อเยื่อนั้นสามารถย้ายลงเลี้ยงในอาหารสูตรปกติของพืชชนิดนั้น ๆ อีกวิธีหนึ่งก็คือ การเก็บรักษาเนื้อเยื่อไว้ในไนโตรเจนเหลวที่ อุณหภูมิต่ำถึง -196 องศาเซลเซียส ในสภาพเช่นนี้เซลล์และเนื้อเยื่อจะคงสภาพและมีชีวิตอยู่ได้ยาวนาน

-พื้นทีปฏิบัติงาน เครื่องมือ อุปกรณ์

พื้นทีปฏิบัติงาน เครื่องมือ อุปกรณ์
การเลี้ยงเนื้อเยื่อเป็นการเลี้ยงชิ้นส่วน เซลล์ โพรโทพลาสต์ บนอาหารสังเคราะห์ ในอาหารสังเคราะห์มีส่วนประกอบที่เหมาะสมกับการเจริญของเชื้อจุลิทรีย์ด้วย ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อจำเป็นที่ต้องทำการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดมากับวัสดุพันธุ์พืช อาหาร เครื่องมือที่ใช้ทั้งหมด โดยเฉพาะอย่างยิ่งเครื่องมือที่ใช้ในการตัดและเลี้ยงเนื้อเยื่อ ซึ่งต้องทำในสภาพปลอดเชื้อ ความสะอาดเป็นหัวใจสำคัญโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ถ้าไม่สะอาดเนื้อเยื่อที่เลี้ยงจะตายเพราะเกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ เพื่อให้ได้สภาพที่ปลอดเชื้อในระดับที่สูง ต้องคำนึงถึงห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยตั้งแต่เริ่มสร้างห้องปฏิบัติการ

การเลือกทำเลที่จะสร้างห้องปฏิบัติการ ดังนี้

- มีฝุ่นน้อย
- มีไฟฟ้า สำหรับในสถานที่ที่มีไฟฟ้าเสียบ่อย ๆ ควรที่จะต้องมีเครื่องกำเนิดไฟฟ้าสำรอง (stand by generator) และมีตัวตัดไฟฟ้าอัตโนมัติในกรณีผิดปกติ เพื่อป้องกันเครื่องใช้ไฟฟ้าต่างเสียหายอาจเนื่องจากกระแสไฟฟ้ากระชาก
- มีแหล่งน้ำสะอาดอย่างสม่ำเสมอ
- ควรเลี่ยงพื้นที่ ที่มีความชื้นเกินไป เพราะความชื้นจะทำให้เกิด การปนเปื้อนได้ค่อนสูงในการเลี้ยง และห่างไกลจากพื้นที่ที่มีการเลี้ยงสัตว์ หรือโรงเห็ด

ส่วนต่างๆ ของห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

สามารถแบ่งเป็นส่วนๆ ได้ดังนี้
1. ห้องพักนักวิจัย ซึ่งจะจัดเป็นมุมเล็กๆ ของห้องในส่วนนี้จะใช้เป็นที่เก็บตำรา หรือเอกสารทางวิชาการสำหรับนักวิจัยด้วย
2. ห้องเก็บสารเคมี เพื่อความสะดวกในการหยิบใช้ ควรเก็บสารเคมีไว้ในที่เฉพาะและเป็นหมวดหมู่ไว้ในตู้วางกับพื้น หรือติดผนังก็ได้
3. ห้องเตรียมอาหาร ส่วนนี้จะต้องการเนื้อที่เพิ่มขึ้นมากกว่าสองห้องแรก สำหรับการเตรียมอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ
4. ห้องย้ายเนื้อเยื่อ ในห้องนี้จะต้องมีความสะอาดและปลอดเชื้อ จึงควรจะปิดกั้นห้องให้สนิท และให้ผู้คนผ่านเข้าออกให้น้อยที่สุดเท่าที่จำเป็น
5. ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ ถ้าเป็นห้องปฏิบัติการที่ไม่ใหญ่นัก ห้องนี้อาจจัดอยู่ร่วมกับห้องย้ายเนื้อเยื่อ ในทำนองเดียวกันห้องนี้ต้องมีความปลอดเชื้อ จะต้องป้องกันเชื้อและรักษาความสะอาดเป็นพิเศษ จึงควรเป็นห้องที่ผู้คนผ่านน้อยที่สุด

อุปกรณ์และเครื่องมือที่จำเป็นสำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

.ในห้องปฏิบัติต่างๆ ดังต่อไปนี้

1. ห้องเตรียมอาหาร ควรมีอุปกรณ์และเครื่องมือ ดังนี้
- เครื่องชั่ง มีทั้งแบบอย่างหยาบ คือ ชั่งน้ำหนักต่ำสุด 0.01 กรัม และอย่างละเอียดชั่งได้ต่ำถึง 0.001 กรัม หรือ 0.0001 กรัม
- ช้อนตักสารเคมี มีทั้งแบบที่เป็นโลหะและที่เป็นพลาสติก
- เครื่องวัดความเป็นกรดเป็นด่าง
- เตาอุ่นความร้อนและเครื่องคน ใช้สำหรับอุ่นหรือหลอมอาหารพร้อมด้วยตัวคนระบบแม่เหล็ก
- เตาอบไมโครเวฟ ใช้สำหรับเคี่ยวหรือหลอมอาหาร นอกจากนี้สามารถใช้เตาลวดความร้อนหรือเตาแก๊สแทนได้ ในกรณีที่เตรียมอาหารคราวละมากๆ เตาแก๊สจะเหมาะสมกว่า
- ตู้เย็น สารเคมีบางตัวมีความจำเป็นที่จะต้องเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิต่ำ เพราะมิฉะนั้นแล้ว จะทำให้เสื่อมคุณสมบัติ ได้ เช่น ฮอร์โมน วิตามิน รวมทั้งสารละลายเข้มข้นของอาหาร
- เตาอบความร้อน ใช้สำหรับอบฆ่าเชื้อที่ติดมากับเครื่องมือ หรืออุปกรณ์ที่สามารถทนต่อความร้อนสูงๆ ได้ เช่น พวกที่เป็นเครื่องแก้วและโลหะ โดยอาศัยความร้อนที่ใช้ คือ ประมาณ 180 องศาเซลเซียส เวลานานประมาณ 3 ชั่งโมง
- หม้อนึ่งความดัน ใช้สำหรับนึ่งฆ่าเชื้อในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ และเครื่องมือที่ไม่สามารถทนต่อความร้อนของเตาอบความร้อนได้ ความดันที่ใช้ประมาณ 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เวลานานประมาณ 15 นาที
- เยื่อกรอง เนื่องจากมีสารเคมีบางชนิดที่ไม่สามารถผ่านการฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันได้ ทำให้เสื่อมคุณภาพได้ จึงต้องกรองโดยมีรูกว้างประมาณ 0.22 ไมครอน ซึ่งสามารถกรองเอาอนุภาคของแบคทีเรียและสปอร์ของราได้
- เครื่องแก้วต่างๆ เช่น หลอดทดลอง ขวด ขวดรูปชมพู่ ปิเปต กรวยแก้ว และแท่งแก้วคนสาร เป็นต้น

2. ห้องย้ายเนื้อเยื่อ ควรมีอุปกรณ์และเครื่องมือ ดังนี้
- ตู้ย้ายเนื้อเยื่อ เป็นตู้กรองอากาศให้บริสุทธิ์ปลอดจากอนุภาคของราและแบคทีเรีย
- ตะเกียง ใช้ตะเกียงแอลกอฮอล์ หรือแก๊ส
- กระดาษกรอง
- จานแก้ว
- มีดผ่าตัดแบบต่างๆ พร้อมใบมีด
- ปากคีบ
3. ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ ควรมีอุปกรณ์และเครื่องมือ ดังนี้
- เครื่องควบคุมอุณหภูมิ ภายในห้องจะต้องมีอุณหภูมิประมาณ 23 องศาเซลเซียส
- ชั้นสำหรับวางขวดเลี้ยงเนื้อเยื่อ ซึ่งมีขนาดที่เหมาะสมสะดวกต่อการทำงานหรือติดตามการปนเปื้อนและการเจริญเติบโต ชั้นต้องไม่สูงเกินไป และต้องมีหลอดไฟให้แสงสว่างด้วยหลอดฟลูออเรสเซนต์ ที่ให้ความสว่างประมาณ 3,000 ลักซ์
- ตัวตั้งเวลา ใช้สำหรับตั้งเวลาในการปิดเปิดไฟ เพื่อกำหนดความยาวของช่วงแสง
- เครื่องเขย่า สำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชในสภาพอาหารเหลว

-อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช


อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

อาหาร ที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีหลายชนิด ทั้งนี้ขึ้นกับความเหมาะสมต่อชนิดของพืช พันธุ์ ตลอดจนชนิดและสภาพของชิ้นส่วนพืชที่จะนำมาเลี้ยง อย่างไรก็ตามอาหารที่นิยมใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมากที่สุด คือ อาหารที่ดัดแปลงมาจากอาหารที่ใช้ได้ดีในการเลี้ยงกลุ่มเซลล์หรือแคลลัส ซึ่งเป็นกลุ่มของเซลล์ที่เริ่มมีการเปลี่ยนแปลงพัฒนามีช่องว่างในเซลล์ จำนวนมาก และเซลล์ยังไม่มีการจัดรูปร่างที่แน่นอน ทั้งนี้เนื่องจากการเลี้ยงแคลลัสและเซลล์แขวนลอย ของพืชส่วนใหญ่เกือบทุกชนิดทำได้ง่ายกว่าการเลี้ยงจากส่วนอื่น ๆ แคลลัสเหล่านี้ได้จากการเลี้ยงชิ้นส่วนพืชในอาหารกึ่งแข็งที่อย่างน้อยที่ สุดประกอบด้วยเกลือของ ธาตุอาหารที่ต้องการครบ คือ สารประกอบอนินทรีย์ และสารประกอบอินทรีย์ ในปริมาณที่ค่อนข้างสูง
แม้พืชทั้งต้นจะมีความต้องการขั้นพื้นฐานในการเจริญเติบโตไม่ซับซ้อนมากนัก ก็ตาม แต่การนำชิ้นส่วนของพืชมาเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์นั้น มีความต้องการธาตุอาหารและสารบางอย่างที่จำเป็นที่มีความซับซ้อนมากกว่า คือ ต้องการทั้งธาตุอาหารหลัก (macro-elements/nutrients) และธาตุอาหารรอง (micro-elements/nutrients) ที่ใช้ตามปกติในการเลี้ยงพืชในสารละลาย นอกจากนั้นยังต้องการธาตุอาหารอื่น ๆ เช่น แหล่งของธาตุคาร์บอน และวิตามินอย่างมาก ปกติแล้วเซลล์หรือเนื้อเยื่อพืชที่แยกมาเลี้ยงจะต้องการวิตามินและ สารควบคุมการเจริญเติบโต (growth regulators) ต่าง ๆ ซึ่งปกติสังเคราะห์ได้เองจากส่วนหนึ่งของต้นเพื่อไปสะสมไว้ยังอีกส่วนหนึ่ง ของต้นพืช แล้วเคลื่อนย้ายไปยังส่วนอื่น ๆ เพื่อใช้ในกระบวนการเมตาโบลิซึม อย่างไรก็ตาม ผลของแต่ละสารประกอบที่จำเป็นนี้ยังไม่เป็นที่ทราบชัดสมบูรณ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีของสารที่ได้จากกระบวนการเมตาโบลิซึม (secondary metabolites) เนื่องจากองค์ประกอบทางเคมีของ สูตรอาหารที่ใช้มักถูกดัดแปลงไปตามความมุ่งหมาย เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของเซลล์ และการเปลี่ยนแปลงพัฒนาเพื่อกำเนิดอวัยวะ (organogenesis) และ/หรือ การกำเนิดคัพภะ (embyogenesis) จึงทำให้ยากต่อการหาข้อสรุปพื้นฐานที่สอดคล้องไปในทางเดียวกันได้โดยง่าย

ประเภทของอาหาร

1. อาหารกึ่งแข็ง (semi-solid medium) เทคนิคที่ใช้ในยุคแรก ๆ นั้น ใช้วุ้น (agar) เพื่อปรับสารละลายอาหารให้มีสภาพเป็นของแข็งมากขึ้น โดยนึ่งใน หม้อนึ่งความดันเพื่อหลอมล.ะลายอาหารแล้วเทใส่ภาชนะและทิ้งให้แข็งตัวอยู่ในสภาพ อาหารกึ่งแข็ง แต่มักพบว่าคุณสมบัติต่าง ๆ ของสารประกอบเคมีในอาหารอาจไม่ได้รับสูงสุดเท่ากับอาหารเหลว (liquid medium) กระนั้นก็ตามวุ้นยังคงถูกนำมาใช้แต่จำเป็นต้องดัดแปลงให้เหมาะสม และต้องแน่ใจว่ามีความบริสุทธิ์จริง ๆ ในทางปฏิบัติแนะนำให้ล้างด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์อย่างน้อย 3 ครั้ง รายงานว่าการเจริญเติบโตของถั่ว Pea abies จะดีที่สุดในอาหารแข็งที่ใช้วุ้น Difco Purified agar ขณะที่ Difco Noble agar ซึ่งผ่านการฟอกใสมากกว่าจะให้ผลที่ไม่ดีเท่า และการใช้วุ้นปริมาณมากเกินไปอาจไปยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อได้ ดังนั้นความเข้มข้นของวุ้นที่พอเหมาะสำหรับอาหารแต่ละชนิดจะต้องมีการทดสอบเสียก่อน อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่ใช้กันแพร่หลายและได้ผลดีเพื่อวัตถุประสงค์ส่วนใหญ่ คือ 0.8 %
สารสังเคราะห์พวก gelatin และ silica gel ได้เคยมีการใช้ และในปัจจุบันมี การพัฒนาสารประกอบพวก acrylamide gels เช่นเดียวกับ starch co-polymers ก็มีการแนะนำมาใช้แทนวุ้น สารเหล่านี้มีข้อดีที่ไม่จำเป็นต้องต้มให้เดือดเพื่อช่วยให้ละลายน้ำได้ แต่ยังมีปัญหาในเรื่องการปรับค่า pH ในขณะที่สารพวกผงถ่าน (charcoal) ถูกเติมในอาหารหลายสูตร เพื่อช่วยกระตุ้นการเจริญเติบโตเนื่องจากสามารถดูดซับสารพิษพวก toxic metabolites ที่เกิดจากเนื้อเยื่อพืชที่เลี้ยงได้ดี
2. อาหารเหลว (liquid medium) อาหารเหลวเป็นที่นิยมใช้อย่างกว้างขวาง เนื่องจากเนื้อเยื่อจะจมหรือแขวนลอยอยู่บนกระดาษกรองที่จุ่มในอาหารเหลว ตลอดเวลา ในทางปฏิบัติอาจาใช้ glass wool ช่วยพยุงเนื้อเยื่อที่เลี้ยงได้เช่นกัน เช่นเดียวกับการใช้ fabric support (100 % polyester) ที่อิ่มตัวด้วยอาหารเหลว ซึ่งจะช่วยในการเจริญเติบโตและการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานเกิดได้ดีขึ้น เนื้อเยื่อที่จมอยู่ในอาหารเหลวอาจถูกคนที่ความเร็ว 1 - 150 รอบต่อนาที (rpm) เพื่อช่วยในการหายใจ
ส่วนประกอบของอาหาร (media constituents)
อาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช จะประกอบด้วยธาตุอาหารต่าง ๆ ที่พืชต้องการอย่างครบถ้วน จึงขอกล่าวส่วนประกอบของอาหาร ดังต่อไปนี้
น้ำ (water)
ประมาณ 95 % ของอาหารเป็นน้ำ ในการทำงานวิจัยควรใช้น้ำกลั่นจาก เครื่องกลั่นแก้ว เครื่องกลั่นควรได้รับการทำความสะอาดอย่างสม่ำเสมอ และควรบรรจุน้ำกลั่นใน ขวดพลาสติก
วุ้น (agar)
เนื้อเยื่อส่วนมากจะเลี้ยงในอาหารแข็งที่มีวุ้น ซึ่งหน้าที่ช่วยพยุงเนื้อเยื่อให้ตั้งอยู่ได้บนอาหาร ในกรณีที่เลี้ยงในอาหารเหลวจะวางบนเครื่องเขย่า หรือเลี้ยงบนสะพานกระดาษกรอง (filter paper bridge) เพื่อให้เนื้อเยื่อได้รับอากาศเพียงพอ วุ้นเป็นส่วนประกอบแพงที่สุด ในอาหาร ผลิตจากสาหร่ายทะเลทำให้อาหารแข็งตัว วุ้นเป็นพอลิแซ็กคาไรด์ (polysaccharide) มีโมเลกุลใหญ่ วุ้นที่มีคุณภาพสูง เช่น difcoitek Agar มีราคาแพงมากปราศจากสิ่งเจือปน ในห้องปฏิบัติการบางแห่งใช้วุ้นประกอบอาหารแทนได้ วุ้นจาก Difco Bacto มักใช้ในปริมาณ 0.6 - 1.0 % เหมาะสำหรับการเลี้ยงแคลลัส ส่วนอะกาโรสเจล (agarose gel) หรือวุ้นสังเคราะห์ใช้เลี้ยงเซลล์เดี่ยวหรือโพรโทพลาสต์ วุ้นสังเคราะห์เหล่านี้จะทำให้เกิดปัญหาการฉ่ำน้ำ (vitrification) ของเนื้อเยื่อพืช ผลิตภัณฑ์ใหม่ของบริษัทซิกมา (Sigma) ชื่อ อะการ์เจล (Agargel) ช่วยลดปัญหานี้ได้ การใช้วุ้นในปริมาณที่ต่ำ (0.5 %) จะทำให้อาหารไม่แข็งตัวไหลไปมาได้ โดยเฉพาะเมื่อมีpHต่ำจึงไม่สามารถพยุงเนื้อเยื่อพืชไว้ได้ แต่ถ้าใช้วุ้นในปริมาณที่สูง (1.0 %) จะทำให้อาหารแข็งมากจนไม่สามารถให้น้ำเพียงพอสำหรับการเจริญเติบโตของพืช และยังทำให้พืชดูดอาหารไปใช้ได้ยาก
แหล่งให้ธาตุคาร์บอน (carbon sources)
เป็นส่วนประกอบที่สำคัญของอาหารทุกสูตร เป็นแหล่งพลังงานที่จำเป็นมากต่อ การเจริญเติบโต เนื่องจากเนื้อเยื่อพืชยังไม่มีการสังเคราะห์แสงในสภาพหลอดแก้ว หรือมี การสังเคราะห์แสงในอัตราที่ต่ำเพราะได้รับแสงน้อย และมีปริมาณของคาร์บอนไดออกไซด์จำกัด น้ำตาลที่นิยมใช้ คือ ซูโครส (sucrose) ซึ่งเป็นชนิดเดียวกับที่พืชสังเคราะห์ได้เอง และ มีความจำเป็นอย่างมากต่อเนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิด โดยปกติมักใช้ในปริมาณ 1 - 5 % และมีหลักฐานชี้ว่าการสร้างสารเมตาโบไลท์บางชนิดในเนื้อเยื่อที่เลี้ยง เป็นผลมาจากความเข้มข้นของซูโครส สำหรับน้ำตาลชนิดอื่น เช่น กลูโคส (glucose) และฟรุคโตส (fructose) มีการใช้บ้างปริมาณที่ใช้ขึ้นอยู่กับชนิดและอายุของพืช โดยทั่วไปพืชจะเจริญเติบโตดีขึ้นเมื่อได้รับปริมาณ น้ำตาลเพิ่มขึ้นจนถึงจุดหนึ่ง จากนั้นการเพิ่มปริมาณน้ำตาลมากขึ้นอีกจะลดการเจริญเติบโตลง น้ำตาลอาจเปลี่ยนรูปได้เมื่อถูกนึ่งฆ่าเชื้อ นอกจากนี้น้ำตาลพอลิแซ็คคาไรด์อาจเปลี่ยนเป็น มอโนแซ็ดคาไรด์ เมื่อเกิดการแยกสลายด้วยน้ำ (hydrolysis)
เกลืออนินทรีย์ (inorganic salt)
ธาตุอาหารมีความสำคัญในการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อรองลงมาจากน้ำตาล แยกออกได้เป็นธาตุอาหารที่พืชต้องการมาก และธาตุอาหารที่พืชต้องการน้อย
แม้ว่าสูตรอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชในระยะแรกจะเหมาะสมต่อการเลี้ยงเซลล์และ แคลลัส แต่ในระยะต่อมา เช่น สูตรของ Murashige and Skoog (MS), Gamborg B-5 และของ Miller ได้รับการพัฒนาให้เหมาะต่อการเลี้ยงส่วนต่าง ๆ ของพืชได้กว้างขวางมากขึ้น ทั้งยังมีผลดีอย่างมากในการกระตุ้นการกำเนิดอวัยวะ โดยมีการกำหนดปริมาณเกลืออนินทรีย์ให้เหมาะต่อการเจริญของเซลล์ที่เลี้ยง แต่ละพืช และในบางกรณีเฉพาะต่อแต่ละพันธุ์ โดยปกติสารละลายเกลืออนินทรีย์ของ Murashige and Skoog (MS-salt solution) ถูกใช้เป็นส่วนผสมหลักเพื่อการเจริญเติบโตของเซลล์ที่เลี้ยง สาเหตุหนึ่งคือ เกลือสูตรนี้มีความเข้มข้นสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง NH4 อิออน และ ธาตุอื่น ๆ บางชนิดมีปริมาณที่สูงมาก (ดังตารางที่ 1) ซึ่งจำเป็นต่อเนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิดที่จะพัฒนา ทั้งยังพบว่า NaH2PO4.2H2O ในสูตรอาหาร MS ยังให้ผลดีแก่เนื้อเยื่อพืชบางชนิด ธาตุอาหารรองที่ใช้ในสูตรอาหารโดยปกติมีการเจือปนของธาตุอื่นและให้ ธาตุอาหารหลัก N, P และ K เพิ่มเติมในปริมาณที่น้อยมาก แต่คุณภาพของธาตุอาหารรองเองก็มีส่วนสำคัญไม่น้อย ในเกลือสูตร MS นั้น มีปริมาณธาตุอาหารรองค่อนข้างสูงเป็นพิเศษเมื่อเทียบกับสูตรอื่น โดยเฉพาะการมีสาร chelating agents เช่น EDTA ยังเป็นหลักประกันว่า ธาตุเหล็กจะมีประโยชน์ในปริมาณที่มากพอ แม้ว่าจะมี pH เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากก็ตาม
วิตามิน (Vitamins)
พืชสามารถสังเคราะห์วิตามินที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตได้ทุกชนิด แต่เซลล์พืชที่เลี้ยงในสภาพหลอดแก้วต้องการวิตามินเพิ่ม โดยเฉพาะวิตามินบี 1 เพื่อช่วยในการพัฒนา ให้เป็นปกติ วิตามินที่ใช้ เช่น วิตามินบี 1 (thiamine 0.1 - 0.5 มก/.) วิตามินบี 5 (pantothenic acid 0.5 - 2.5 มก/.) วิตามินเอ็ม (folic acid 0.1 - 0.5 มก/.) วิตามินบี 2 (riboflavin 0.1 - 10.0 มก/.) วิตามินเอช (biotin 0.01 - 1.00 มก/.) และวิตามินอี (tocopherol 1 - 50 มก/.) ถึงอย่างวิตามินในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนั้น มีลักษณะที่ใช้ตามกันมากกว่าจะมีการพิสูจน์หรือทดสอบก่อนว่ามีความจำเป็น อย่างแท้จริงหรือไม่ มีเพียง thiamine-HCl เท่านั้นที่ดูจะมีความจำเป็น และเป็นที่ต้องการในการเจริญเติบโตหรือการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐาน (morphogenesis)
ความเป็นกรดและด่างของอาหาร (pH of nutrient medium)
pH ที่เหมาะสมของอาหารที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชอยู่ในช่วง 5.0 - 6.5 ถ้าต่ำมากไป ( <4.5 ) หรือสูงมากเกินไป (>7.6) จะทำให้พืชหยุดการเจริญเติบโต ถ้า pH สูงกว่า 6 จะทำให้อาหารแข็งมาก ถ้า pH ต่ำกว่า 5.2 อาหารวุ้นจะอ่อนตัว ไม่เหมาะในการพยุงเนื้อเยื่อพืช นอกจากนี้จากการศึกษาพบว่าผลในการกระตุ้นการเจริญเติบโตและ การเลือกกระตุ้นของอาหารที่ใช้เลี้ยงนั้นจะขึ้นอยู่กับ pH ด้วย ที่มีค่าสูงหรือต่ำเกินไปควรหลีกเลี่ยงเพราะจะไปขัดขวางความเป็นประโยชน์ ของธาตุอาหาร ตัวอย่าง pH ที่เป็นด่าง (>7.0) หรือเป็นกรดจัด (<4.0) ทำให้กรดจิบเบอเรลลินไม่เป็นประโยชน์ได้ การเติมสารประกอบ EDTA ลงในอาหารอาจมีความสำคัญในการรักษาความเป็นประโยชน์ของธาตุเหล็กและธาตุ โลหะอื่น ๆ เนื่องจาก pH จะเปลี่ยแปลงไปตลอดเวลาขณะเพาะเลี้ยง


ฮอร์โมนพืชและสารควบคุมการเจริญเติบโต (Hormones and growth regulators)
ฮอร์โมนที่สร้างขึ้นในต้นพืช (plant hormones) ทำหน้าที่กระตุ้นและมีส่วนร่วม ในกระบวนการต่าง ๆ ที่นำไปสู่การพัฒนาของต้นที่เป็นปกติการเจริญเติบโตตลอดจน การเปลี่ยนแปลงพัฒนาของเซลล์ เนื้อเยื่อ และ secondary metabolism เป็นผลมาจากฮอร์โมนเหล่านี้ทั้งสิ้น การเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตลงในอาหารจึงอาจไม่จำเป็นเสมอไปโดยเฉพาะในการเลี้ยงแคลลัส อย่างไรก็ตามโดยปกติจะมีส่วนช่วยในการเพิ่มอัตราการเจริญเติบโตและ/หรือการกำเนิดอวัยวะ และมีเนื้อเยื่อพืชไม่กี่ชนิดที่สร้างแคลลัสได้ในอาหารที่ปราศจาก สารควบคุมการเจริญเติบโต
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ออกซินและไซโทไคนินมีความสำคัญที่สุด พืชบางชนิดสร้างสารเหล่านี้อยู่แล้ว แต่ควรเพิ่มเข้าไปในอาหารเพื่อช่วยให้การเจริญดีขึ้น บางครั้งอาจต้องใช้จิบเบอเรลลิน หรือ เอทิลีน การเก็บฮอร์โมนพืชมักเก็บในตู้เย็นในรูปสารละลายเข้มข้น การนำฮอร์โมนพืชไปใช้อาจมีปัญหาการทำละลายของฮอร์โมนพืชในน้ำ การละลายออกซินควรทำในด่าง เช่น 0.1 KOH ไซโทไคนินก็เช่นเดียวกัน แต่จิบเบอเรลลินละลายได้ไดีในแอลกอฮอล์ ออกซินและไซโทไคนินที่เตรียมเป็นสารละลายเข้มข้นควรเก็บไว้ในที่มืด หรือใส่ขวดสีชาเพราะจะเสื่อมสภาพเมื่อได้รับแสง
1. ออกซิน (auxin) เช่น IAA (indole acetic acid) IBA (indole butyric acid) NAA (naphthalene acetic acid) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) ใช้ในช่วง 0.01- 10 มก/. ออกซินช่วยเพิ่มขนาดของเซลล์ มักใช้ร่วมกับไซโทไคนินเพื่อช่วยใน การแบ่งเซลล์ การสร้างราก แต่การเจริญของรากจะถูกยับยั้งถ้ามีออกซินในปริมาณที่สูง
2. ไซโทไคนิน (cytokinin) ไซโทไคนินที่สังเคราะห์ได้ในธรรมชาติ คือ ซีอะทิน (zeatin) ใช้ในการกระตุ้นการเจริญเติบโต ไซโทไคนินที่ใช้กันมากคือ ไคเนทิน (kinetin) 2iP (N6-isopentenyl adenine) BAP (benzyl aminopurine) มีหน้าที่ส่งเสริมการแบ่งเซลล์โดยเฉพาะถ้าใช้ร่วมกับออกซิน ถ้าใช้ในความเข้มข้นสูงขึ้นจะช่วยในสร้างราก แต่ยับยั้งการเจริญของรากส่งเสริมการสร้างยอดโดยลดผลจากการที่ตายอดข่มตาข้าง มีบทบาทในการเปลี่ยน สภาพเซลล์เป็นอวัยวะได้และชักนำให้เกิดเป็นต้น ไซโทไคนินทนความร้อนได้ดีจึงมักเติมในอาหารก่อนฆ่าเชื้อ บทบาทของออกซินและไซโทไคนินในพืชทั้งต้นและในสภาพหลอดแก้วอาจจะเหมือนกันหรือไม่เหมือนกันก็ได้
3. จิบเบอเรลลิน (gibberellin) ฮอร์โมนพืชกลุ่มนี้มี 60 กว่าชนิด แต่ GA3 เป็นชนิดที่ใช้มากที่สุด จิบเบอเรลลินไมค่อยใช้กันมากนักในงานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช มีบทบาทในการชักนำให้ปล้องยาวขึ้นหลังจากการสร้างยอด ช่วยให้เนื้อเยื่อเจริญมีการเจริญเติบโตและช่วยในการงอกของเมล.็ด ไม่ควรฆ่าเชื้อจิบเบอเรลลินด้วยหม้อนึ่งความดัน เพราะจิบเบอเรลลิน ส่วนหนึ่งจะเสื่อมสลายไปเมื่อได้รับความร้อน ควรทำให้ปลอดเชื้อโดยใช้เครื่องกรองเมมเบรน นอกจากนี้จิบเบอเรลลินนั้นเคยถูกนำมาใช้ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชแต่โดยทั่ว ๆ ไป มีผลปิดกั้น การเกิดอวัยวะ
4. แอบซาซิกแอซิค (ABA; abscisic acid) มักยับยั้งการเจริญเติบโต ในสภาพปลอดเชื้อแต่ในบางครั้งพบว่า เอบีเอส่งเสริมการเจริญของแคลลัส และการเกิด เป็นต้นใหม่ และการเกิดเป็นต้นใหม่ ควรทำให้สารนี้ปลอดเชื้อโดยใช้เครื่องกรองเมมเบรน เอบีเอมีบทบาทเกี่ยวกับ การสังเคราะห์ไซโทไคนินและเป็นตัวต่อต้านการทำงานของ จิบเบอเรลลิน
5. เอทิลีน (ethylene) อวัยวะพืช แคลลัส หรือเซลล์ในสภาพหลอดแก้วมีการผลิตเอทิลีน จึงไม่ควรปิดหลอดแก้วแน่นเกินไปเพื่อไม่ให้เกิดการสะสมของแก๊สนี้ ผลของเอทิลีนมีทั้งส่งเสริม และยับยั้งการเจริญเติบโต การเลี้ยงเนื้อเยื่อในที่มีแสง จะมีการสะสมเอทิลีนมากกว่า ในที่มืด ถ้ามีมากเกินไปจะทำให้เกิดการฉ่ำน้ำของพืชได้ แก๊สนี้ยังเป็นสาเหตุของการแก่ของเนื้อเยื่อพืช
สารอินทรีย์ (organic salt)
. สารอินทรีย์จากผักหรือผลไม้ที่สำคัญมากคือ น้ำมะพร้าว น้ำส้ม น้ำมะเขือเทศ สารสกัดจากยีสต์ น้ำแอปเปิล กล้วยบด สารเหล่านี้ไม่ควรใช้ในงานวิจัย เนื่องจากไม่ทราบส่วนประกอบแน่นอน (undefined medium) ในระยะที่นำมาใช้
. สารอินทรีย์ที่มีไนโตรเจนเป็นส่วนประกอบ เช่น กรดอะมิโน ช่วยส่งเสริม การเจริญเติบโต และทำให้เซลล์มีการเปลี่ยนแปลงพร้อมที่จะเกิดเป็นต้นได้ เช่น แคซีนไฮโดรไลเซท (casein hydrolysate) 0.1 - 1.0 มก/. ทริพโทน (tryptone) 0.25 - 2.00 มก/. และสารสกัดจากมอลท์ (malt extrat) 0.5 - 10 มก/. สารเหล่านี้ประกอบด้วยวิตามินและกรดอะมิโน ส่วนสารสกัดจากยีสต์ (yeast extract) ซึ่งมีวิตามินบีสูงมักใช้ในปริมาณ 0.25 - 2.00 มก/. ดังตารางที่ 3
อะดีนิน (adenine)
การใส่อะดีนินในอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมีประโยชน์คือ ช่วยในการผลิตยอดแต่ยังไม่ทราบกลไกการทำงานแน่ชัด
ผงถ่าน (activated charcoal)
มักใช้ในความเข้มข้น 0.2 - 3.0 % ในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ ผงถ่านมี ความสามารถในการดูดซับสารบางตัวออกจากอาหารได้ เนื่องจากผงถ่านมีช่องว่างที่ ละเอียดมาก มีพื้นที่ผิวในช่องว่างสูง จึงใช้ผงถ่านในการดูดซับสารพิษ เช่น สารประกอบฟีนอล (phenol) เอทิลีน ทำให้ปริมาณสารดังกล่าวในอาหารลดลง เช่น การดูดซับฮอร์โมนหรือ สารประกอบฟีนอล ซึ่งเป็นพิษกับเซลล์ นอกจากนี้อาจใช้ผงถ่านในระยะที่เกิดรากเพื่อลดแสงบริเวณราก และทำให้รากเจริญเติบโตได้ดี ผงถ่านจึงสำคัญต่อการสร้างเป็นต้นใหม่ สารที่มีคุณสมบัติเหมือนกันกับผงถ่าน คือ PVP (polyvinyl pyrolidone) ก็สามารถดูดซับสาร ฟีนอลได้ หรือการเติม diethyl-dithiocarbonate (DIECA) จะช่วยป้องกันการเกิดออกซิเดชั่น

-การเตรียมชิ้นส่วนพืช

การเตรียมชิ้นส่วนพืช

อิทธิพลของสภาพเนื้อเยื่อก่อนเพาะเลี้ยง (Pre-conditioning effects)
สภาพของเนื้อเยื่อพืชก่อนนำมาเพาะเลี้ยงอาจมีผลเช่นกัน สภาพเหล่านี้ได้แก่
1. ฤดูกาล
- ฤดูกาล ซึ่งจะมีช่วงแสง อุณหภูมิ และปัจจัยสภาพแวดล้อมอื่น ๆ ที่แตกต่างกันในการเพาะเลี้ยงยาสูบปัจจัยเหล่านี้จะมีผลต่อการเกิดอวัยวะ
- ช่วงเวลาการดูแลรักษา ตลอดจนปุ๋ย และสารเคมีที่ใช้
- แม้กระทั่งตำแหน่งของเนื้อเยื่อที่แยกออกมาจากต้นในแต่ละฤดูกาลมาใช้ก็มีผลเช่นเดียวกัน
2. ธาตุอาหาร
สภาพความอุดมสมบูรณ์ของดิน และธาตุอาหารที่พืชได้รับ อาจมีผลต่อความแข็งแรง สุขภาพ และศักยภาพของเนื้อเยื่อที่นำมาใช้ โดยเฉพาะการใส่ปุ๋ยในช่วงก่อนแยกเอาเนื้อเยื่อมาใช้ อาจมีผลทำให้การตอบสนองของเนื้อเยื่อเปลี่ยนแปลงได้
3. แสง
การเปลี่ยนแปลงสภาพความเข้มแสงที่พืชได้รับ อาจทำให้การตอบสนองของเนื้อเยื่อและเซลล์พืชเปลี่ยนแปลงไปได้ ตัวอย่างในยาสูบ ความเข้มข้นแสงที่เพิ่มมากขึ้นทำให้มีการตอบสนองต่อการเพาะเลี้ยงเพิ่มขึ้น ขณะที่การเพาะเลี้ยงเซลล์พืชบางชนิด โดยเฉพาะ โพรโทพลาสมีความต้องการแสงน้อยลงหรือต้องการสภาพมืด
4. สารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช
การให้สารกระตุ้นการเจริญเติบโตก่อนแยกเนื้อเยื่อพืชมาใช้ มักช่วยกระตุ้นการตอบสนองให้ดีขึ้น ตัวอย่างใช้กรดจิบเบอเรลลิก (GA3) เพื่อชักนำให้เกิด juvenile tissues ที่ง่ายต่อการเพาะเลี้ยงในยาสูบ และส้ม หรือใช้สารชะลอการเจริญเติบโต (growth retardants) เช่น CCC (B-chloroethyl-trimethyl ammonium chloride) ในใบมะเขือเทศ ทำให้ความแข็งแรงของเนื้อเยื่อลดลง
5. การปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์
การลดปริมาณจุลินทรีย์ในเนื้อเยื่อพืชที่เพาะเลี้ยง โดยใช้สารเคมีต่าง ๆ สารกำจัดเชื้อรา (fungicides) สารปฏิชีวนะ (antibiotics) เพื่อกำจัดเชื้อแบคทีเรีย สารกำจัดไวรัส (antiviral agents เช่น virozol) การใช้ความร้อน (heating) หรือการอบแห้ง (drying out) อาจทำให้ความชีวิตและความแข็งแรงของเนื้อเยื่อลดลงได้
โดยปกติแล้ว พืชทีปลูกในเรือนควบคุมสภาพแวดล้อม (growth chamber หรือ controlled room) มักให้ชิ้นส่วนพืชที่สะอาดและปลอดโรค จึงเหมาะต่อการใช้เพาะเลี้ยงมากกว่าพืชที่ปลูกในเรือนปลูกพืชทดลอง หรือในสภาพไร่ ซึ่งยากต่อการหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนจาก จุลินทรีย์และเชื้อโรค

การเลือกชิ้นส่วน

ขนาด ของเนื้อเยื่อ โดยเนื้อเยื่อที่มีขนาดใหญ่จะง่ายต่อการปนเปื้อนจากจุลินทรีย์และเชื้อโรค ต่าง ๆ ขณะที่เนื้อเยื่อขนาดเล็กมีโอกาสหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนได้ดีขึ้น อย่างไรก็ตาม ขนาดของเนื้อเยื่อที่เล็กที่สุดที่มีประสิทธิภาพ เป็นสิ่งที่ควรพิจารณา เนื่องจากเนื้อเยื่อเจริญที่มีขนาดเล็กเกินไปอาจโตช้า และไม่ตอบสนองต่อการเพาะเลี้ยงเท่าเนื้อเยื่อที่มีขนาดใหญ่ หากเกิดสภาพเครียดหรือซ็อคจากการแยก ในทางปฏิบัตินิยมแก้ไขโดยเลี้ยงเนื้อเยื่อขนาดเล็กหลาย ๆ ชิ้นในภาชนะ (ขวด) เดียวกัน เพื่อกระตุ้นให้มีการตอบสนองต่อการเพาะเลี้ยงมากขึ้นแต่อาจเกิดปัญหาอิทธิ ผลของชิ้นส่วนจากแคลลัสที่โตเร็วกว่าการเลี้ยงเนื้อเยื่อเพียงชิ้นเดียวมาก ทำให้ต้องย้ายเนื้อเยื่อและเปลี่ยนอาหารบ่อยครั้งขึ้น ซึ่งเป็นการสิ้นเปลืองทั้งเวลา แรงงาน และค่าใช้จ่าย ทั้งยังเพิ่มความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนมากขึ้นด้วย

1. การเลือกต้นแม่พันธุ์ ควรพิจารณาดังนี้
1.1 พันธุ์ นอกจากการเลือกชนิดพืชที่ต้องการแล้ว นิสัยของพืชที่เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ง่าย หรือมีการสร้างรากง่ายขึ้นอยู่กับพันธุกรรม ถ้าเป็นไปได้ควรเลือกหลายพันธุ์ เนื่องจากบางพันธุ์อาจขยายพันธุ์โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อง่ายกว่าพันธุ์อื่น โดยทั่วไปพืชที่ขยายพันธุ์ง่ายด้วยวิธีการปักชำ มักจะขยายพันธุ์ได้ง่ายโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
1.2 สภาพของต้นแม่พันธุ์ ชิ้นส่วนพืชที่เริ่มต้น ที่จะนำมาเลี้ยงควรมาจากต้นที่แข็งแรง จะทำได้สำเร็จมากกว่าการนำมาจากต้นที่อ่อนแอ
1.3 หลีกเลี่ยงเนื้อเยื่อที่ได้จากต้นแม่พันธุ์ที่เป็นโรค ควรเลือกเฉพาะเนื้อเยื่อที่สมบูรณ์แข็งแรงปลอดโรค
2. ชิ้นส่วนของพืช (explant)
ทุกส่วนของพืชที่ประกอบด้วยเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่สามารถนำมาทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ทั้งนั้น แต่ความสามารถในการเจริญเติบโตอาจแตกต่างกันเพราะเซลล์แต่ละชนิดมีความตื่นตัว (active) ไม่เท่ากัน เนื้อเยื่อพืชที่มีเซลล์ตื่นตัวมากที่สุดคือเนื้อเยื่อเจริญ ซึ่งพบได้ในส่วนต่าง ๆ ดังนี้
2.1 ส่วนปลายยอดของลำต้น (shoot apex) เป็นบริเวณที่เซลล์มีการแบ่งตัวมากที่สุด ส่วนนี้นับจากปลายยอดสุดลงมาไม่เกิน 5 มิลลิเมตร
2.2 ส่วนปลายราก (root apex) ถัดจากส่วนของหมวกราก ก็จะมีส่วนที่ประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญคล้ายกับส่วนของปลายยอด
2.3 เนื้อเยื่อเจริญในท่อลำเลียง (vascular cambium) เป็นเนื้อเยื่อเจริญที่พบในส่วนของลำต้นและราก ซึ่งอยู่ระหว่างกลุ่มของท่ออาหาร และท่อน้ำ
2.4 เนื้อเยื่อเจริญที่อยู่ระหว่างปล้อง (intercalary meristem) ซึ่งจะพบในพืชพวก ใบเลี้ยงเดี่ยว ทำหน้าที่ในการเพิ่มความยาวของปล้อง
นอกจากนี้มีเนื้อเยื่อส่วนอื่น ๆ ที่สามารถนำทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้มีดังนี้
- ส่วนของเปลือกชั้นใน (inner bark) ซึ่งส่วนนี้ประกอบด้วยเนื้อเยื่อของชั้น phloem และ cortex
- ส่วนไส้ (pith) เป็นส่วนที่ในใจกลางสุดของลำต้นซึ่งประกอบด้วยเซลล์พวก parenchyma
- ใบ (leaf) ในส่วนของใบมีเซลล์ของแผ่นใบที่เรียกว่า palisade parenchyma และ spongy parenchyma อยู่จำนวนมาก ซึ่งนิยมใช้สำหรับแยกโพรโทพลาสต์
- ดอก (flower) ส่วนของดอกส่วนใหญ่ประกอบด้วยเซลล์พวก parenchyma ยกเว้นในส่วนของก้านดอก (peduncle) และฐานรองดอก (receptacle) ซึ่งอาจมีเนื้อเยื่อเจริญอยู่ด้วยยกตัวอย่างในฐานรองดอกของเยอบีร่าและ เบญจมาศที่สามารถชักนำให้เกิดต้นได้ดี
- ผล (fruit) เนื้อเยื่อของผลส่วนใหญ่ประกอบด้วยเซลล์พวก parenchyma โดยเฉพาะอย่างยิ่งในผลสด (fleshy fruit) ชนิดที่ผลมีเปลือกหุ้มผลนิ่มทั้งผล มักมีเมล็ดมากมาย (berry) เช่น กล้วย มะละกอ ละมุด ส่วนผลมีผนังชั้นนอกของเปลือกหุ้มผล พัฒนามาจากฐานรองดอก เมื่อผลแก่ผนังนี้จะแข็งและเหนียวแน่น ภายในผลนิ่มทั้งผล (pepo) เช่น พืชตระกูลแตง เป็นต้น และผลที่มีเปลือกหนาคล้ายหนังและมีต่อมน้ำมันจำนวนมาก ข้างในผลแยกเป็นส่วนๆ ชัดเจน (hesperidium) เช่น พืชตระกูลส้ม เป็นต้น
- เมล็ด (seed) ในส่วนของเมล็ดซึ่งประกอบด้วยคัพภะ (embryo) ใบเลี้ยง (cotyledon) และ endosperm ทั้งสามส่วนนี้ให้ความสำเร็จสูงในการเพาะเลี้ยง

การฟอกฆ่าเชื้อชิ้นส่วน

เนื้อ เยื่อที่จะนำมาเพาะเลี้ยงจะต้องผ่านการฆ่าเชื้อเพื่อกำจัดเชื้อจุลินทรีย์ ที่อาจมีติดอยู่ที่บริเวณผิวของเนื้อเยื่อออกเสียก่อนด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (sterilizing agent) ซึ่งมีอยู่หลายชนิด การเลือกชนิดของน้ำยาฆ่าเชื้อและสภาวะที่เหมาะสมสำหรับเนื้อเยื่อพืชแต่ละ ชนิด เป็นสิ่งสำคัญที่ต้องคำนึงถึงซึ่งจะต้องทำการทดลองหา
สารเคมีที่นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการใช้คือ โซเดียมไฮโปคลอไรต์ (sodium hypochlorte) แคลเซียมไฮโปคลอไรต์ (calcium hypochlorite) ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (hydrogen peroxide) เป็นต้น
ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ใช้น้ำยาฟอกขาวที่ใช้ในบ้าน เช่น Clorox ผลิตภัณฑ์นี้มีโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 5.25 % อัตราที่ใช้ คือ 10-20 % สารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์จะทำงานได้ไม่ดีเมื่อมี pH มากกว่า 8 และจะมีประสิทธิภาพสูงที่สุดเมื่อสารละลายมี pH 6 และเพื่อให้การทำงานของคลอรีนมีประสิทธิภาพมากขึ้น ในการฆ่าเชื้อบริเวณผิวพืช ควรเติมสบู่เหลวเข้าไปในสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ เช่น Tween20 2 - 3 หยด ถ้าไม่มีสามารถใช้น้ำยาล้างจาน และในขณะที่ทำการฆ่าเชื้อบริเวณผิวพืช ต้องเขย่าสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ ตลอดเวลาหรืออาจวางบนเครื่องเขย่าได้ เวลาในการฆ่าเชื้อด้วยสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ขึ้นอยู่กับชนิดของพืช ว่าทนต่อสารละลายคลอรีน นานแค่ไหน ถ้ามีความทนทานมากก็ใช้เวลานานขึ้นได้
มีสารเคมีหลายชนิดและวิธีการต่างๆ ที่ใช้ในการทำความสะอาดให้ตัวอย่างพืช
ให้มีความปลอดเชื้อ ซึ่งผู้ทำการเพาะเลี้ยงต้องใช้ดุลยพินิจในการเลือกใช้ให้เกิดความเหมาะสม กับเนื้อเยื่อพืชและประสิทธิภาพที่จะได้รับ ซึ่งมีแนวทางในการเลือกใช้ ดังนี้
1. มีประสิทธิภาพดี ให้เปอร์เซ็นต์ความปลอดเชี้อสูง
2. ราคาไม่แพง และหาซื้อได้ง่าย
3. เตรียมได้ง่าย ไม่มีขั้นตอนที่ยุ่งยาก
4. ไม่เป็นอันตราย หรือมีอันตรายน้อยที่สุดต่อสิ่งมีชีวิตทั้งคนและชิ้นตัวอย่างพืช

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อตายอดและตาข้าง

ตายอดและตาข้างเป็นชิ้นส่วนที่มีเนื้อเยื่อเจริญ (meristemmatic tissue) ที่มี การตื่นตัว (active) อยู่ตลอดเวลา เหมาะแก่การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ซึ่งจะมีเปอร์เซ็นต์ ความสำเร็จสูง มีขั้นตอนดังนี้
1. ตัดเอาส่วนของยอดหรือตามาทำการแยกเอาใบและก้านใบออกให้หมด หรือถ้ามีใบเกล็ด ที่ห่อหุ้มตาอยู่ก็ให้แกะออกจนสังเกตเห็นส่วนของตา
2. แช่ในสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 10 % หรือสารละลายโซเดียม ไฮโปคลอไรต์ ความเข้มข้น 2 % เติม tween-20 ในอัตราส่วน 1 หยด ต่อสารละลาย 100 มิลลิลิตร หรือประมาณ 0.01 % เพื่อช่วยให้สารละลายจับกับผิวตัวอย่างได้ดี
3. ทำการเขย่าเป็นระยะ ๆ หรือวางไว้บนเครื่องเขย่าเป็นเวลาประมาณ 15 นาที
4. ล้างเอาสารละลายออกด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง ๆ ละประมาณ 5 นาที
5. ย้ายตัวอย่างไปวางผึ่งบนจานแก้วให้แห้งพอหมาด ๆ แล้วทำการตัดแต่งพืชตัวอย่าง เพื่อทำการเพาะเลี้ยงต่อไป

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อชิ้นส่วนของแผ่นใบ

ใบพืชเป็นอวัยวะที่ค่อนข้างจะบอบบางเนื่องจากประกอบด้วยเนื้อเยื่อเพียงไม่กี่ชั้นเซลล์ โอกาสที่เนื้อเยื่อจะตายหรือได้รับอันตราย จากสารเคมีที่ใช้ฟอกฆ่าเชื้อมีมาก จึงมีความจำเป็นที่ต้องระมัดระวังเป็นพิเศษ มีขั้นตอนดังนี้
1. เลือกใบพืชที่สมบูรณ์ มาทำความสะอาดด้วยน้ำสบู่ เพื่อขจัดคราบฝุ่นและเศษซากของแมลงที่อาจติดอยู่กับใบ และเป็นการช่วยลดแรงตึงผิวของใบด้วย
2. แช่ใบในสารละลายคลอร๊อกซ์ความเข้มข้น 5 % เวลาประมาณ 10 นาที โดยทำการเขย่าเป็นระยะ ๆ หรือวางบนเครื่องเขย่า
3. ล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที
4. ย้ายตัวอย่างลงในจานแก้ว เพื่อทำการตัดแต่งตัวอย่าง และทิ้งไว้ให้แห้ง พอหมาด ๆ จึงย้ายลงเลี้ยงในอาหาร

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดพืช

เมล็ดพืชเป็นอวัยวะที่มีความแข็งแรงทนทานกว่าส่วนอื่น ๆ สามารถทนต่อสารเคมีที่มีความเข้มข้นสูง ๆ ได้ดี จึงเป็นการสะดวกในการฟอกฆ่าเชื้อ ประกอบกับเนื้อเยื่อต่าง ๆ ที่อยู่ภายในเมล็ด คือ คัพภะ และใบเลี้ยง มีสภาพที่มีความปลอดเชื้อสูง จึงเหมาะแก่การใช้ในการเริ่มต้นการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
เนื่องจากเมล็ดพืชมีความแตกต่างกันมาก จึงมีเทคนิคการฟอกฆ่าเชื้อแตกต่างกันด้วยดังนี้
1. การฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดที่มีลักษณะแข็ง เช่น ถั่วต่าง ๆ หน่อไม้ฝรั่ง น้อยหน่า เป็นต้น มีขั้นตอนดังนี้
(1). แช่เมล็ดในแอลกอฮอล์ ความเข้มข้น 95 % นานประมาณ 5 นาที เพื่อการฆ่าเชื้อที่ติดมากับเมล็ด และช่วยขจัดคราบไขมันบริเวณผิวเมล็ด
(2). ถ่ายเอาแอลกอฮอล์ออก ผึ่งเมล็ดไว้ให้แห้ง
(3). แช่เมล็ดในสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 20 % เติม tween-20 ประมาณ 0.01 % ทิ้วไว้ประมาณ 20 นาที
(4). ทำการล้างเมล็ดด้วยน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที
(5). ย้ายเมล็ดลงเลี้ยงในอาหาร
2. การฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดที่มีความอ่อนนุ่มหรือเมล็ดที่ยังไม่แก่เต็มที่ (immature seed) มีขั้นตอนดังนี้
(1). ถ้าเมล็ดมีเยื่อห่อหุ้ม เช่น เมล็ดมะเขือเทศจะมีลักษณะคล้ายวุ้น หรือเมล็ดมะละกอที่มีผนังเมล็ดที่เป็นเยื่อใส ๆ และสารละลายเหลว ๆ ห่อหุ้มอยู่ ก็ให้ทำการกำจัดออกเสียก่อน เพราะสิ่งดังกล่าวเหล่านั้นเป็นตัวยับยั้งการงอกของเมล็ด
(2). แช่เมล็ดในสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 15 % เติม tween-20 ประมาณ 0.01 % ทิ้วไว้ประมาณ 15 นาที
(3). ทำการล้างเมล็ดด้วยน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที
(4). ย้ายเมล็ดลงเลี้ยงในอาหาร

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อของกิ่งไม้

ส่วนของกิ่งไม้ประกอบด้วยเนื้อเยื่อที่ยังมีชีวิตที่จะใช้ทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ ก็คือ กลุ่มเนื้อเยื่อของท่อลำเลียงอาหาร เนื้อเยื่อแคมเบียม และเนื้อเยื่อตรงใจกลางของ ลำต้น ซึ่งเนื้อเยื่อดังกล่าวอยู่ในส่วนภายในของกิ่งหรือลำต้น ซึ่งมีสภาพที่ปลอดเชื้ออยู่แล้ว ฉะนั้นการฟอกฆ่าเชื้อจึงทำเฉพาะผิวนอกเท่านั้น ซึ่งมีขั้นตอนดังนี้
1. นำส่วนของกิ่งหรือลำต้นมาลนไฟ หรือจุ่มแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 95 % ก่อนแล้วเผาไฟ ก็จะสามารถฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวของตัวอย่างได้
2. ใช้มีดผ่าและตัดแยกเอาเฉพาะเนื้อเยื่อที่ยังมีชีวิตอยู่ดังกล่าวข้างต้น ลงเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงได้เลย

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้ออับเรณู

การเพาะเลี้ยงอับเรณูมีวัตถุประสงค์เพื่อการผลิตพืชที่มีโครโมโซมชุดเดียว (haploid plant) จากเซลล์สร้างสปอร์ (microspore mother cell) ที่อยู่ภายในอับเรณู มีขั้นตอนดังนี้
1. เลือกดอกที่ยังตูม โดยที่กลีบเลี้ยงและกลีบดอกยังไม่กางออก มากทำการฉีดพ่นด้วยแอลกอฮอล์ ความเข้มข้น 70 % ทิ้วไว้ให้แห้งพอหมาด ๆ
2. แช่ดอกสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 10 % เติม tween-20 ประมาณ 1 - 2 หยด ทิ้งไว้ประมาณ 15 นาที โดยเขย่าเป็นระยะ ๆ
3. ล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที
4. ย้ายดอกลงในจานแก้ว ผึ่งให้แห้งพอหมาด ๆ แล้วทำการแกะดอกแยกเอาเฉพาะอับเรณูลงเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยง

-การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
อวัยวะและเนื้อเยื่อของพืชประกอบด้วยเซลล์จำนวนมากเมื่อนำไปเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์จึงมีโอกาสที่เจริญเติบโตได้ ถ้าเป็นเนื้อเยื่อที่กำลังเจริญเติบโตโอกาสที่เนื้อเยื่อสามารถเจริญได้ก็มีมากกว่าเนื้อเยื่อถาวรปฐมภูมิ การนำอวัยวะหรือเนื้อเยื่อ ส่วนใดมาเลี้ยงก็ขึ้นอยู่กับจุดประสงค์ ความสะดวกและผลที่ควรจะได้เช่น การนำเอาเนื้อเยื่อสะสมอาหาร มาเพาะเลี้ยงก็เพื่อให้ได้กลุ่มเนื้อเยื่อหรือต้นที่ได้มีจำนวนโครโมโซมเป็น triploid (3n) เป็นต้น

วิธีการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช มีหลายวิธี ได้แก่


1. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด(shoot tip culture)
เนื้อเยื่อปลายยอดของพืชเป็นกลุ่มของเนื้อเยื่อเจริญซึ่งประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (apical meristems) และจุดกำเนิดของใบ กลุ่มเนื้อเยื่อเหล่านี้มีเซลล์ที่อยู่กันแน่น รูปร่างค่อนข้างกลม ไม่มีช่องว่างระหว่างเซลล์ (intercellular space) เซลล์สามารถแบ่งตัว ได้เรื่อย ๆ การนำเอาเนื้อเยื่อเจริญไปเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์เรียกว่า การเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อเจริญ หรือถ้านำเอาเฉพาะเนื้อเยื่อเจริญปลายยอดไปเพาะเลี้ยงจึงเรียกว่า การเพาะเลี้ยงปลายยอด หรือถ้ามีจุดกำเนิดของใบติดมาด้วย เรียกว่า shoot tip culture หรือ shoot apex culture
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อธรรมดาสามารถป้องกันและ กำจัดได้เฉพาะเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราเท่านั้น ส่วนเชื้อไวรัสไม่สามารถกำจัดได้ แต่สามารถเลี้ยงกำจัดโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัสได้โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อ เยื่อเจริญ ดังนั้นการเพาะเลี้ยงปลายยอดของพืชจึงเป็นเทคนิคที่ใช้ในการผลิตต้นพืชที่ ปราศจากไวรัสได้ ดังนั้นการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อปลายยอดจึงนับว่าเป็นประโยชน์มากในการกำจัด เชื้อไวรัสที่ทำให้เกิดโรคแก่พืชที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจ ได้แก่ สตรอเบอรี่ กระเทียม เบญจมาศ กล้วยไม้ เป็นต้น นอกจากนั้นยังสามารถ ขยายพันธุ์พืชได้จำนวนมากและมีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนเดิม
เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอด เนื้อเยื่อจากปลายยอดของพืช เพาะเลี้ยงได้เกือบทุกชนิด เนื้อเยื่อปลายยอดมีขนาดเล็ก วิธีการนำเอามาเพาะเลี้ยงจึงจำเป็นต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ชนิด 2 ตา ช่วยในการตัดเอาเนื้อเยื่อ วิธีการนำเอาเนื้อเยื่อเจริญปลายยอดของพืชแต่ละชนิดอาจแตกต่างกันไปบ้าง

2. การเพาะเลี้ยงใบ (leaf culture)
ใบเป็นอวัยวะของพืชที่ประกอบด้วยแผ่นใบ และก้านใบ การเจริญเติบโตของใบในระยะเริ่มแรกอยู่ใกล้กับปลายยอด โดยมีจุดกำเนิดของใบเจริญและพัฒนามาเป็นใบ จุดกำเนิดของใบประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญ สามารถแบ่งตัวได้จนถึงระยะหนึ่ง จากนั้นจึงมีการเปลี่ยนแปลง ไปเนื้อเยื่อถาวรปฐมภูมิ แผ่นใบประกอบด้วยเนื้อเยื่อเอนปิเดอมิส ทั้งทางด้านบนและด้านล่าง ส่วนระหว่างกลางเป็นกลุ่มเนื้อเยื่อของเมโซฟิล วิธีการเพาะเลี้ยงใบหรือเนื้อเยื่อจากใบ ใบของพืชแต่ละชนิดมีลักษณะแตกต่างกัน ใบที่สามารถนำมาเพาะเลี้ยงและสามารถเจริญเติบโตได้มักเป็นใบที่ยังอ่อนอยู่ ประกอบด้วยเซลล์ที่สามารถแบ่งตัวได้ เมื่อนำชิ้นส่วนใบมาเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ เนื้อเยื่อสามารถเจริญเติบโตเป็นแคลลัสหรือเจริญเติบโตเป็นหน่อขนาดเล็กตามบริเวณรอยตัดหรือบนผิวของใบ

3. การเพาะเลี้ยงราก (Root culture)
การเพาะเลี้ยงรากของพืชพวกใดยากหรือง่ายนั้นไม่สามารถที่จะกำหนดลงไปได้ ถึงแม้ว่าความสำเร็จส่วนใหญ่ที่รายงานได้ทำการเพาะเลี้ยงรากของพืชใบเลี้ยง คู่ที่เป็นไม้เนื้ออ่อน จึงทำให้เกิดความเข้าใจผิดว่ารากของพืชใบเลี้ยงเดี่ยวหรือพืชไม้เนื้อแข็ง เพาะเลี้ยงยาก แม้แต่พันธุ์ที่อยู่ในสปีชีส์เดี่ยวกันก็มีความแตกต่างกัน
อาหารสังเคราะห์ที่ใช้เลี้ยงรากนั้นต้องใส่น้ำตาลซูโครสเพื่อเป็นแหล่งคาร์บอน แต่ถ้าเป็นรากของธัญญพืชอาจใช้กูลโคสได้ดี ความเป็นกรดเป็นด่างที่เหมาะสำหรับของเจริญของรากคือ 5.0 - 5.5 ส่วนความเป็นกรด-ด่าง 6.0 - 6.5 เหมาะสำหรับทำให้เกิดรากแขนงได้ดี ความเข้มของแสงในระดับต่ำ ๆ สามารถทำให้การเจริญได้ดีในรากของพืชบางชนิด รากของพืชบางชนิดอาจถูกยับยั้งการเจริญเติบโตเมื่อได้รับแสง อุณหภูมิที่เหมาะสมคือ 25 - 27 ๐ ซ
การนำเอารากของพืชที่ปลูกอยู่ในเรือนต้นไม้หรือในแปลงมาเพาะเลี้ยงนั้นค่อนข้างลำบาก ปัญหาที่สำคัญคือ การทำให้ปราศจากเชื้อจุลินทรีย์ค่อนข้างยาก เนื่องจากเชื้อรา และแบคทีเรียจะอาศัยอยู่ตามรอยแตกของรากและบางทีก็อาศัยอยู่ระหว่างเซลล์ของพืช การกำจัดเชื้อจุลินทรีย์จึงอาจทำอันตรายแก่รากได้ การเพาะเลี้ยงรากจึงควรนำมาจากการเลี้ยงเมล็ดในสภาพปลอดเชื้อ โดยนำเมล็ดฟอกฆ่าเชื้อแล้วนำไปเพาะในอาหาร วิธีการที่จะช่วยให้ปราศจากเชื้อได้ดีก็โดยลอกเอาส่วนของเปลือกหุ้มเมล็ดออก การเพาะเมล็ดในที่มืดจะช่วยในรากเจริญได้ดีรากย่อยที่เจริญมาจากแคลลัสหรือส่วนของอวัยวะอื่น ๆ สามารถนำมาใช้เป็นชิ้นส่วนได้

4. การเพาะเลี้ยงคัพภะ (Embryo culture)
การเพาะเลี้ยงคัพภะนั้น คัพภะที่อยู่ในระยะรูปร่างกลม (globular stage) ประกอบด้วยเซลล์ 50 เซลล์ เป็นคัพภะขนาดเล็กที่สามารถแยกและนำมาเพาะเลี้ยงให้ เจริญเติบโตได้ ความพยายามที่จะแยกเอาไซโกต (zygote) ของพืชชั้นสูงและเพาะเลี้ยงให้เจริญเปลี่ยนแปลงไปเป็นคัพภะในหลอดแล้วนั้นยังไม่สำเร็จ
เมื่อนำคัพภะที่เจริญเต็มที่แล้วแต่มีขนาดเล็กกว่าปกติไปเลี้ยงในอาหาร สังเคราะห์ คัพภะสามารถเจริญเติบโตได้ในทางตรงข้ามคัพภะที่ยังไม่มีการเปลี่ยนแปลงไป เป็นส่วนต่าง ๆ นั้นมี ความต้องการอาหารมากขึ้น อาจต้องเติมอาหารเสริม เช่น น้ำมะพร้าว ในบางกรณีก็ต้องให้ความเข้มข้นของน้ำตาลซูโครสเพิ่มเป็น 8 - 12 % การให้ฮอร์โมนพวกออกซินและไซโตไคนินในปริมาณที่เหมาะสมก็ช่วยให้คัพภะเจริญ ได้ดีขึ้น

5. การเพาะเลี้ยงรังไข่ (Ovary culture)
การเพาะเลี้ยงรังไข่ได้รับความสำเร็จในพืชบางชนิด ซึ่งมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาของรังไข่แบบง่าย ๆ และผลแก่เร็ว ผลที่เกิดจากการเพาะเลี้ยงรังไข่จะมีขนาดเล็กกว่าผลที่เจริญมาจากต้นโดยตรง การเจริญของรังไข่ก็คล้ายคลึงกับรังไข่ที่เจริญอยู่บนต้น ผลที่สุดก็ไม่มีลักษณะที่ผิดปกติ การเพาะเลี้ยงรังไข่ซึ่งได้รับการผสมแล้ว จะมีเมล็ดที่สมบูรณ์ซึ่งสามารถเจริญเติบโตได้ แต่จะมีจำนวนของเมล็ดน้อยกว่าผลที่แก่จากต้น
จุดมุ่งหมายของการเพาะเลี้ยงรังไข่ส่วนใหญ่ก็เพื่อศึกษาการเกิดผลประโยชน์ ที่น่าสนใจของการเพาะเลี้ยงรังไข่อีกอย่างหนึ่งก็คือในแง่ของการผสมพันธุ์ พืช เนื่องจากการผสมพันธุ์พืชบางชนิดผลมักจะร่วงไปก่อนที่จะแก่เต็มที่ ดังนั้นถ้านำเอารังไข่ที่ผสมแล้วมาเพาะเลี้ยงก็แน่ใจว่า จะได้เมล็ด
ความต้องการสำหรับการเลี้ยงรังไข่ การเลี้ยงรังไข่ควรดึงเอากลีบเลี้ยงออกเสียก่อนจะช่วยให้การเจริญของรังไข่ดีขึ้น สำหรับรังไข่ที่เอามาจากดอกซึ่งได้รับการผสมแล้ว 2 - 3 วัน อาหารที่ใช้เลี้ยงไม่ต้องใส่ฮอร์โมน ตรงข้ามกับรังไข่ที่เอามาจากดอกที่ไม่ได้รับการผสมต้องให้ออกซิน และบางกรณีให้ไซโตไคนินหรือจิบเบอเรนลินหรือทั้ง 2 อย่าง

6. การเพาะเลี้ยงโอวูล (Ovule culture)
การเพาะเลี้ยงโอวูลได้ดัดแปลงมาเพื่อใช้เลี้ยงคัพภะ ซึ่งจะเพาะเลี้ยงโอวูลก่อนที่จะเกิดมีคัพภะในขนาดที่เหมาะสม จนกว่าคัพภะมีขนาดโตพอที่สามารถแยกและเพาะเลี้ยงได้ โอวูลสามารถแยกมาเพาะเลี้ยงได้หลังจากเกิดการถ่ายละอองเกสรแล้ว 2 - 3 วัน แต่ไซโกต ยังไม่แบ่งตัว

7. การเพาะเลี้ยงตาดอก (Flower bud culture)
เป็นประโยชน์ในการศึกษาว่าสภาวะแวดล้อมที่สามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงไป เป็นส่วนต่าง ๆ ของดอก เช่น เกสรตัวผู้ เกสรตัวเมีย กลีบดอกและส่วนอื่น ๆ ได้อย่างไร นอกจากนั้นยังเป็นประโยชน์ในการศึกษาเกี่ยวกับการกำหนดเพศ (sex expression) และ ปรากฏการณ์ของการสืบพันธุ์อื่น ๆ
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อให้ออกดอกในหลอดแล้วอาจทำได้ 3 วิธี คือ
. ตัดตาดอกนำไปเพาะเลี้ยงโดยตรง
. กระตุ้นให้ปลายยอดที่เลี้ยงออกดอก
. ดอกเกิดจากส่วนอื่น ๆ ที่นำไปเพาะเลี้ยง เช่น ลำต้น ใบ รากและส่วนอื่น ๆ

วิธีการดูแลรักษาพืชในสภาพขวดแก้ว

สภาพแวดล้อม สิ่งแวดล้อมที่สำคัญในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ แสง และอุณหภูมิ ส่วนความชื้นนั้นถูกควบคุมอยู่แล้วเมื่อเลี้ยงในสภาพหลอดแก้ว การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโดยมากจะเลี้ยงที่อุณหภูมิประมาณ 20 - 25 ๐ ซ ใช้แสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์ โดยให้มีความเข้มข้นของแสงประมาณ 3,000 ลักซ์ แสงเท่านี้ก็เพียงพอในการให้พืชเจริญอยู่ได้ปกติ แต่ไม่เพียงพอต่อการสังเคราะห์แสงซึ่งไม่จำเป็นในระยะนี้เนื่องจากมีน้ำตาลอยู่ในอาหารแล้ว ช่วงแสงให้ประมาณ 12 - 16 ชั่วโมง บางครั้งให้ได้รับแสงตลอด 24 ชั่วโมง
นอกจากนีเมื่อเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เลี้ยงทั้งบนอาหารกึ่งแข็งหรือในอาหาร เหลวจะต้องมีการถ่ายเนื้อเยื่อลงอาหารใหม่ตามเวลาอันเหมาะสม การเลี้ยงเนื้อเยื่อไว้ในอาหารเดิมนาน ๆ จะทำให้เกิดภาวะขาดธาตุอาหารและมีของเสียที่เนื้อเยื่อถ่ายออกมาสะสมอยู่ เป็นผลให้เนื้อเยื่อหยุดเจริญเติบโตและตายได้ โดยทั่วไปจะต้องถ่ายเนื้อเยื่อที่เลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งทุก 4 - 6 สัปดาห์ และที่เลี้ยงในอาหารเหลว ทุก 2 - 4 สัปดาห์ แล้วแต่ชนิดของพืช การถ่ายเนื้อเยื่อในระยะแรกควรนำเนื้อเยื่อที่ได้ทั้งหมดถ่ายลงอาหารใหม่จน กระทั่งได้เนื้อเยื่อที่อยู่ในสภาพที่แข็งแรงสมบูรณ์ ในระยะต่อมาจึงถ่ายเนื้อเยื่อเฉพาะบางส่วนที่สมบูรณ์ที่สุดและ ชิ้นส่วนพอเหมาะ ถ้าชิ้นส่วนเนื้อเยื่อเล็กมากเกินไปจะทำให้เนื้อเยื่อมีโอกาสรอดน้อย แสงสว่างมีส่วนช่วยให้เนื้อเยื่อเจริญเติบโตได้เร็วขึ้น สิ่งสำคัญที่ต้องระวังในการถ่ายเนื้อเยื่อจะต้องใช้เทคนิคที่ปราศจากเชื้อ

การเพิ่มปริมาณเนื้อเยื่อพืช

เมื่อ เนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนพืชตั้งตัวได้ในสภาพปลอดเชื้อ จุดประสงค์ต่อไป คือ การเพิ่มจำนวนของยอด พืชบางชนิดจะเกิดรากในอาหารพื้นฐานเช่นเดียวกับกิ่งปักชำเล็ก ๆ ซึ่งเป็นสิ่งที่ไม่ต้องการเนื่องจากว่าควรมีการเจริญเพิ่มปริมาณยอดก่อน พืชบางชนิดผลิตยอดจำนวนมากโดยไม่ใช้สารควบคุมการเจริญเติบโต ดังนั้นการใช้อาหารจึงควรพิจารณาระดับของสารควบคุมการเจริญเติบโตที่พืช ต้องการ ลักษณะของการเพิ่มจำนวน การทำให้แตกยอดจำนวนมากทำได้หลายวิธี
- ปลายยอดมีการเจริญยืดยาวเป็นข้อและปล้อง ตัดแต่ละข้อไปขยายพันธุ์ได้
- ตาข้างผลิตยอด ยอดดังกล่าวผลิตจากตาบริเวณซอกใบ ทำให้ได้ยอดจำนวนมาก
- พืชหลายชนิดสร้างราก ยอด หัวจากชิ้นส่วนพืชซึ่งปกติไม่สร้างอวัยวะดังกล่าววิธีการนี้เรียกว่า organogenesis เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพกว่า 2 แบบแรก ตัวอย่าง เช่น ใบ 1 ใบ สามารถผลิตตาและยอดใหม่ได้เป็นจำนวนมาก แต่ละต้นจะมีลักษณะเหมือนต้นแม่ทุกประการ
- การสร้างเอ็มบริออยด์ (somatic embryogenesis) เป็นวิธีที่มีศักยภาพมากที่สุดในการขยายพันธุ์ โดยขั้นแรกเซลล์เดี่ยวจะผลิตเอ็มบริออยด์ และพัฒนาไปเป็นต้น การสร้าง เอ็มบิรออยด์เกิดได้ทั้งในเซลล์แขวนลอยหรือการเลี้ยงแคลลัส การชักนำให้เกิดเป็นเอ็มบริออยด์ต้องใช้อาหารที่มีไนโตรเจนต่ำกว่าปกติ
โดยทั่ว ๆ ไปอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงปกติแล้ว การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อชักนำการเกิดยอด (shoot initiation) และเพิ่มจำนวนยอด (shoot multiplication) สามารถใช้อาหารที่มีส่วนประกอบหรืออาจใช้สูตรอาหารที่ใกล้เคียงกันได้ แต่เนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนมีความต้องการกระตุ้นจาก สารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกต่างกัน พืชส่วนมากเปลี่ยนแปลงพัฒนาเป็นอวัยวะถ้าได้รับ สารควบคุมการเจริญเติบโต 2 กลุ่ม คือ ออกซิน และ ไซโตไคนิน ทั้งนี้ผันแปรขึ้นกับชนิดของพืช ระยะการเจริญเติบโตของชิ้นส่วน และระดับหรือสัดส่วนของสารควบคุมการเจริญเติบโต ทั้ง 2 ชนิดที่ใช้ในสูตรอาหาร มีข้อสังเกตสำคัญคือ
- ถ้าสัดส่วนของไซโตไคนินต่อออกซินสูงขึ้น (ไซโตไคนิน > ออกซิน) จะกระตุ้นการเกิดยอด (shoot formation)
- ถ้าสัดส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินสูงขึ้น (ออกซิน >ไซโตไคนิน) จะกระตุ้นการเกิดราก (root induction)
อย่างไรก็ตามในกรณีการสร้างยอดและกระตุ้นการแตกกิ่งข้าง สารควบคุมการ- เจริญเติบโตทั้ง 2 ชนิดนี้จะต้องมีอยู่ในอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง ยกเว้นในพืชบางชนิดที่อาจต้องการไซโตไคนินเพียงอย่างเดียวเท่านั้น ในทางปฏิบัติต้องมีการทดสอบหาสัดส่วนของสารควบคุมการ-เจริญเติบโตที่เหมาะสม
นอกจากนี้หลังจากผลิตยอดได้จำนวนมากพอแล้ว จำเป็นต้องให้ยอดเหล่านี้ได้รับสภาพที่เหมาะสมเพื่อเกิดการยืดตัวของยอด โดยเลี้ยงบนอาหารที่ไม่มีสารควบคุมการเจริญเติบโต การเติมจิบเบอเรลลินในอาหารมีผลช่วยทำให้ปล้องยืดยาวขึ้นได้ ถ้ายอดมีการผลิตได้มีปล้อง ยาวพอแล้วก็ไม่จำเป็นต้องผ่านขั้นตอนนี้
จำนวนพืชที่ผลิตได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จะแตกต่างไปตามสภาพที่เลี้ยง และ ชนิดของพืช ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนพืชเพียงชิ้นเดียวต่อปี ขึ้นอยู่กับอัตราการขยายพันธุ์และจำนวนครั้งที่มีการถ่ายเนื้อเยื่อ

คิดอัตราการทวีคูณจำนวนต้นสามารถคำนวณได้

เมื่อทราบสิ่งสำคัญ 2 ประการ คือ
1. อัตราการขยายพันธุ์ (ยอดต่อชิ้นส่วน)
2. ระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อ (สัปดาห์ต่อครั้ง)

การคำนวณจำนวนต้นที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

จำนวนต้นกล้าที่สามารถทำการเพาะเลี้ยงได้ภายในระยะเวลา 1 ปี
= อัตรการขยายพันธุ์{[52-ระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อ(จำนวนสัปดาห์ต่อครั้ง)]/ระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อ}
(จำนวนยอดต่อชิ้นส่วน)
ตัวอย่าง
สมมุติเบญจมาศมีอัตราการขยายพันธุ์โดยเกิดยอดได้ 10 ยอดต่อชิ้นส่วน และมีระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อคือ 4 สัปดาห์ต่อครั้ง
ดังนั้นปริมาณต้นที่ได้ในระยะเวลา 1 ปี
= 10 {[52-4]/4} = 1012 =1,000,000,000,000 ต้น
เมื่อคิดเพียง 6 เดือน จะมีจำนวนต้น = 10[12/2] = 106 = 1,000,000 ต้น

ปัจจัยที่มีผลต่อการเพิ่มจำนวนต้น

อาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง (media used)
การเพาะเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนยอดสามารถใช้อาหารที่มี ส่วนประกอบของเกลือสูตร MS-salts ได้ผลดีและอาจใช้สูตรอาหารที่ใกล้เคียงกันได้ แต่ที่สำคัญต้องประกอบด้วย เกลืออนินทรีย์ MS-inorganic salts, 170 มก/. NaH2PO4.H20 80 มก/. adenine sulphate dihydrate, 0.4 มก/. thiamine HCl, 100 มก/. inositol และ 3 % ซูโครส ซึ่งใช้ได้ผลดีกับพืชแทบทุกชนิด อย่างไรก็ตามในบางพืชความเข้มข้นของเกลือดังกล่าวอาจสูงเกินไปหรือสูงเกินความจำเป็น ความต้องการสารกระตุ้นการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อผันแปรขึ้นกับระบบที่ใช้ใน การเพาะเลี้ยง และวิธีการขยายหรือเพิ่มจำนวนยอด
ฮอร์โมน (hormones)
พืชส่วนมากเปลี่ยนแปลงพัฒนาเป็นอวัยวะถ้าได้รับฮอร์โมน 2 กลุ่ม คือ ออกซิน และไซโตไคนิน ทั้งนี้ผันแปรขึ้นกับชนิดพืช ระยะการเจริญเติบโตของชิ้นส่วนพืช และระดับหรือสัดส่วนของฮอร์โมนทั้ง 2 ชนิด ที่ใช้ในสูตรอาหาร ซึ่งมีข้อสังเกตสำคัญคือ
- ถ้าสัดส่วนของไซโตไคนินต่อออกซินสูงขึ้น (ไซโตไคนิน > ออกซิน) จะกระตุ้นการเกิดยอด (shoot formation)
- ถ้าสัดส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินสูงขึ้น (ออกซิน > ไซโตไคนิน) จะกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงพัฒนาเพื่อกำเนิดราก (root differentiation)
อย่างไรก็ตามในกรณีการสร้างยอด (adventitious shoot formation) และกระตุ้น การแตกกิ่งข้าง (enhanced axillary branching) ฮอร์โมนทั้ง 2 ชนิด นี้จะต้องมีอยู่ในอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง ยกเว้นในพืชบางชนิดที่อาจต้องการไซโตไคนินเพียงอย่างเดียวเท่านั้น
แสงและอุณหภูมิ (light and temperature)
แม้ว่าโดยปกติแล้วการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชในอาหารสังเคราะห์จะไม่พึ่ง การสังเคราะห์แสงมากนัก แสงก็ยังมีความจำเป็นต่อกระบวนการเปลี่ยนแปลงพัฒนาทางด้านสัณฐานที่ถูกควบคุมด้วยพันธุกรรม โดยทั่ว ๆ ไปแล้วต้องการความเข้มแสงในช่วง 1,000 - 5,000 ลักซ์ ทั้งนี้ขึ้นกับชนิดของพืชด้วย ตัวอย่าง ยอดของเยอบีรา และไม้ดอกล้มลุกหลายชนิด ต้องการความเข้มแสงอย่างต่ำประมาณ 3,000 ลักซ์ และที่เหมาะสมที่สุดคือประมาณ 1,000 ลักซ์ ถ้าความเข้มแสงสูงเกิน 3,000 ลักซ์ จะมีผลในทางยับยั้งได้ สำหรับความยาวนานของช่วงแสง (photoperiod) กล่าวได้ว่าไม่ค่อยมีข้อจำกัด และนิยมใช้แสงนาน 16/8 ชั่วโมง กลางวัน/กลางคืน สำหรับอุณหภูมิคงที่ 25 ๐ ซ นิยมใช้มากที่สุด แม้ว่าในพืชบางชนิดอาจได้ผลดีกว่าหากใช้อุณหภูมิสลับที่สูงหรือต่ำกว่านี้ก็ตาม

อาการฉ่ำน้ำ (vitrification หรือ hyperhydricity)
บางครั้งอาจเกิดขึ้นได้ ถ้าหากมีการย้ายเนื้อเยื่อบ่อยครั้ง ซึ่งจะทำให้เนื้อเยื่อ ลดความแข็งแรง และผ่าเหล่าง่าย ดังนั้นในการขยายพันธุ์จึงควรรักษาแม่พันธุ์ไว้โดยที่ไม่ ย้ายเปลี่ยนอาหารบ่อยครั้ง และการย้ายเปลี่ยนอาหารบ่อยครั้งยังทำให้เกิดรากมากขึ้นด้วย

วิธีการชักนำราก


หลังจากที่ได้จำนวนยอดตามต้องการแล้ว ระยะต่อไปคือ การชักนำให้ยอดเกิดรากในสภาพหลอดแก้วหรือโดยการปักชำธรรมดา สำหรับพืชที่ออกรากง่าย การย้ายออกสู่ภายนอกเพื่อให้ออกรากจะประหยัดกว่า เพราะไม่ต้องเสียค่าใช้จ่ายในการเตรียมอาหารเพิ่มและไม่ต้องทำงานภายใต้สภาพปลอดเชื้อ ถ้าเป็นพืชที่ออกรากยากควรให้ออกรากในอาหารที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตก่อนย้ายออกปลูก
การให้พืชออกรากภายนอกหลอดแก้วหรือขวด จะต้องจัดสภาพการเลี้ยงดูให้เหมาะสมควรให้ความชื้นสูงเพื่อป้องกันการแห้ง เหี่ยวของพืช อาจจุ่มกิ่งพืชขนาดเล็กที่ผลิตได้ให้ออกรากได้ในออกซินชนิดผง หรือชนิดน้ำเหมือนการปักชำกิ่งธรรมดา ข้อดีของการให้กิ่งพืชออกราก ภายนอกคือ ปกติรากที่สร้างในสภาพหลอดแก้ว จะได้รับการปรับสภาพให้เหมาะสมกับสภาพน้ำหรืออาหารที่ได้รับ แต่ไม่ได้ปรับตัวให้เข้ากับสภาพดิน ดังนั้นรากเหล่านี้อาจทำงานไม่ดีในสภาพดินปลูก และจะต้องสร้างรากใหม่ที่ปรับสภาพได้ในดินขึ้นมาแทนหลังย้ายลงดิน การย้ายลงดินเพื่อให้ออกรากทำให้พืชไม่เสียพลังงานในการสร้างรากชนิดใหม่ ในพืชบางชนิดจะเห็นรากฝอยเกิดขึ้นในระยะที่มีการเพิ่มจำนวนต้น บางชนิดสามารถสร้างรากได้ในอาหารที่ไม่มีไซโตไคนิน บางชนิดก็ต้องการสารควบคุมการเจริญเติบโตในการสร้างราก ทั้งนี้พืชแต่ละชนิดต้องการสภาพการเลี้ยง ส่วนประกอบของอาหาร และระดับของสารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกต่างกันไป เช่นเดียวกับระยะอื่นของการขยายพันธุ์ในสภาพปลอดเชื้อ ปัจจัยต่าง ๆ เช่น pH และแสง เป็นต้นมีผลเกี่ยวข้อง การปรับสภาพของต้นพืชขนาดเล็กที่ผลิตได้ก่อนที่จะย้ายลงไปยังอาหารที่ออก รากก็ช่วยส่งเสริมการเกิดรากได้ เช่น การให้แสงหรือการให้ความเย็น การปรับสภาพ ดังกล่าวก็ช่วยส่งเสริมการเกิดรากได้เช่นกัน

วิธีการนำต้นออกปลูก

การ ให้พืชออกรากภายในหรือภายนอกหลอดแก้วก็ตาม เมื่อนำพืชออกมาสู่สภาพ ภายนอกนั้น ต้นพืชต้องเผชิญกับสิ่งแวดล้อมใหม่ และจะเครียดถ้าไม่มีการเตรียมป้องกันระยะนี้เป็นระยะวิกฤตที่สุดในการขยาย พันธุ์พืชในสภาพปลอดเชื้อ อัตราการตายของต้นพืชสูงมากถ้าการจัดการไม่ดีพอ เนื่องจากในสภาพหลอดแก้วพืชได้รับความชื้นสูง ไม่มีเชื้อปนเปื้อน ได้รับอาหาร และความเข้มของแสงที่เหมาะสม ดังนั้นจึงต้องได้พืชปรับตัวที่ละน้อยก่อนย้าย ออกปลูก เพราะถ้าพืชพบสภาพที่เปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วจะตายได้ ตัวอย่างเช่น ใบที่ผลิตในสภาพหลอดแก้วภายใต้ความชื้นสูงและคายน้ำต่ำ จะมีชั้นของคิวติเคิล (cuticle) ที่บางและ ปากใบเปิดมาก และการเลี้ยงในสภาพความเข้มของแสงต่ำ ทำให้มีการสร้างคลอโรฟิลล์ต่ำ การให้พืชปรับตัวเช่น การลดความชื้นในขวดโดยการคลายฝาขวด การเพิ่มปริมาณวุ้น การลดปริมาณน้ำตาล และการเพิ่มความเข้มของแสงให้สัปดาห์ก่อนหน้าที่จะมีการย้ายออกปลูก อาจช่วยให้เกิดการสร้างคลอโรฟิลล์เพิ่มขึ้นทำให้การสังเคราะห์แสงเพิ่มขึ้น การดูแลกิ่งพืชที่ย้ายออกมาจากหลอดแก้ว จะเหมือนกับการดูแลกิ่งอ่อนปักชำ ซึ่งจะต้องให้ได้รับความชื้นสูงและความเข้มของแสงต่ำในตอนแรก แล้วจึงเริ่มเพิ่มความเข้มของแสง และลดความชื้นใน สัปดาห์ต่อมา เครื่องปลูกที่ใช้ในการชำนั้นควรเก็บความชื้นได้ดี และมีการระบายน้ำดี ดินที่ใช้ ไม่จำเป็นต้องฆ่าเชื้อ แต่ควรระวังเรื่องความสะอาดให้มากภายใต้สภาพความชื้นสูง