-การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

อวัยวะและเนื้อเยื่อของพืชประกอบด้วยเซลล์จำนวนมากเมื่อนำไปเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์จึงมีโอกาสที่เจริญเติบโตได้ ถ้าเป็นเนื้อเยื่อที่กำลังเจริญเติบโตโอกาสที่เนื้อเยื่อสามารถเจริญได้ก็มีมากกว่าเนื้อเยื่อถาวรปฐมภูมิ การนำอวัยวะหรือเนื้อเยื่อ ส่วนใดมาเลี้ยงก็ขึ้นอยู่กับจุดประสงค์ ความสะดวกและผลที่ควรจะได้เช่น การนำเอาเนื้อเยื่อสะสมอาหาร มาเพาะเลี้ยงก็เพื่อให้ได้กลุ่มเนื้อเยื่อหรือต้นที่ได้มีจำนวนโครโมโซมเป็น triploid (3n) เป็นต้น

วิธีการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช มีหลายวิธี ได้แก่

1. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด(shoot tip culture)

เนื้อเยื่อปลายยอดของพืชเป็นกลุ่มของเนื้อเยื่อเจริญซึ่งประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (apical meristems) และจุดกำเนิดของใบ กลุ่มเนื้อเยื่อเหล่านี้มีเซลล์ที่อยู่กันแน่น รูปร่างค่อนข้างกลม ไม่มีช่องว่างระหว่างเซลล์ (intercellular space) เซลล์สามารถแบ่งตัว ได้เรื่อย ๆ การนำเอาเนื้อเยื่อเจริญไปเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์เรียกว่า การเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อเจริญ หรือถ้านำเอาเฉพาะเนื้อเยื่อเจริญปลายยอดไปเพาะเลี้ยงจึงเรียกว่า การเพาะเลี้ยงปลายยอด หรือถ้ามีจุดกำเนิดของใบติดมาด้วย เรียกว่า shoot tip culture หรือ shoot apex culture

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชโดยใช้เทคนิคปลอดเชื้อธรรมดาสามารถป้องกันและ กำจัดได้เฉพาะเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราเท่านั้น ส่วนเชื้อไวรัสไม่สามารถกำจัดได้ แต่สามารถเลี้ยงกำจัดโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัสได้โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อ เยื่อเจริญ ดังนั้นการเพาะเลี้ยงปลายยอดของพืชจึงเป็นเทคนิคที่ใช้ในการผลิตต้นพืชที่ ปราศจากไวรัสได้ ดังนั้นการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อปลายยอดจึงนับว่าเป็นประโยชน์มากในการกำจัด เชื้อไวรัสที่ทำให้เกิดโรคแก่พืชที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจ ได้แก่ สตรอเบอรี่ กระเทียม เบญจมาศ กล้วยไม้ เป็นต้น นอกจากนั้นยังสามารถ ขยายพันธุ์พืชได้จำนวนมากและมีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนเดิม

เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอด เนื้อเยื่อจากปลายยอดของพืช เพาะเลี้ยงได้เกือบทุกชนิด เนื้อเยื่อปลายยอดมีขนาดเล็ก วิธีการนำเอามาเพาะเลี้ยงจึงจำเป็นต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ชนิด 2 ตา ช่วยในการตัดเอาเนื้อเยื่อ วิธีการนำเอาเนื้อเยื่อเจริญปลายยอดของพืชแต่ละชนิดอาจแตกต่างกันไปบ้าง

2. การเพาะเลี้ยงใบ (leaf culture)

ใบเป็นอวัยวะของพืชที่ประกอบด้วยแผ่นใบ และก้านใบ การเจริญเติบโตของใบในระยะเริ่มแรกอยู่ใกล้กับปลายยอด โดยมีจุดกำเนิดของใบเจริญและพัฒนามาเป็นใบ จุดกำเนิดของใบประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญ สามารถแบ่งตัวได้จนถึงระยะหนึ่ง จากนั้นจึงมีการเปลี่ยนแปลง ไปเนื้อเยื่อถาวรปฐมภูมิ แผ่นใบประกอบด้วยเนื้อเยื่อเอนปิเดอมิส ทั้งทางด้านบนและด้านล่าง ส่วนระหว่างกลางเป็นกลุ่มเนื้อเยื่อของเมโซฟิล วิธีการเพาะเลี้ยงใบหรือเนื้อเยื่อจากใบ ใบของพืชแต่ละชนิดมีลักษณะแตกต่างกัน ใบที่สามารถนำมาเพาะเลี้ยงและสามารถเจริญเติบโตได้มักเป็นใบที่ยังอ่อนอยู่ ประกอบด้วยเซลล์ที่สามารถแบ่งตัวได้ เมื่อนำชิ้นส่วนใบมาเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ เนื้อเยื่อสามารถเจริญเติบโตเป็นแคลลัสหรือเจริญเติบโตเป็นหน่อขนาดเล็กตามบริเวณรอยตัดหรือบนผิวของใบ

3. การเพาะเลี้ยงราก (Root culture)

การเพาะเลี้ยงรากของพืชพวกใดยากหรือง่ายนั้นไม่สามารถที่จะกำหนดลงไปได้ ถึงแม้ว่าความสำเร็จส่วนใหญ่ที่รายงานได้ทำการเพาะเลี้ยงรากของพืชใบเลี้ยง คู่ที่เป็นไม้เนื้ออ่อน จึงทำให้เกิดความเข้าใจผิดว่ารากของพืชใบเลี้ยงเดี่ยวหรือพืชไม้เนื้อแข็ง เพาะเลี้ยงยาก แม้แต่พันธุ์ที่อยู่ในสปีชีส์เดี่ยวกันก็มีความแตกต่างกัน

อาหารสังเคราะห์ที่ใช้เลี้ยงรากนั้นต้องใส่น้ำตาลซูโครสเพื่อเป็นแหล่งคาร์บอน แต่ถ้าเป็นรากของธัญญพืชอาจใช้กูลโคสได้ดี ความเป็นกรดเป็นด่างที่เหมาะสำหรับของเจริญของรากคือ 5.0 - 5.5 ส่วนความเป็นกรด-ด่าง 6.0 - 6.5 เหมาะสำหรับทำให้เกิดรากแขนงได้ดี ความเข้มของแสงในระดับต่ำ ๆ สามารถทำให้การเจริญได้ดีในรากของพืชบางชนิด รากของพืชบางชนิดอาจถูกยับยั้งการเจริญเติบโตเมื่อได้รับแสง อุณหภูมิที่เหมาะสมคือ 25 - 27 ๐ ซ

การนำเอารากของพืชที่ปลูกอยู่ในเรือนต้นไม้หรือในแปลงมาเพาะเลี้ยงนั้นค่อนข้างลำบาก ปัญหาที่สำคัญคือ การทำให้ปราศจากเชื้อจุลินทรีย์ค่อนข้างยาก เนื่องจากเชื้อรา และแบคทีเรียจะอาศัยอยู่ตามรอยแตกของรากและบางทีก็อาศัยอยู่ระหว่างเซลล์ของพืช การกำจัดเชื้อจุลินทรีย์จึงอาจทำอันตรายแก่รากได้ การเพาะเลี้ยงรากจึงควรนำมาจากการเลี้ยงเมล็ดในสภาพปลอดเชื้อ โดยนำเมล็ดฟอกฆ่าเชื้อแล้วนำไปเพาะในอาหาร วิธีการที่จะช่วยให้ปราศจากเชื้อได้ดีก็โดยลอกเอาส่วนของเปลือกหุ้มเมล็ดออก การเพาะเมล็ดในที่มืดจะช่วยในรากเจริญได้ดีรากย่อยที่เจริญมาจากแคลลัสหรือส่วนของอวัยวะอื่น ๆ สามารถนำมาใช้เป็นชิ้นส่วนได้

4. การเพาะเลี้ยงคัพภะ (Embryo culture)

การเพาะเลี้ยงคัพภะนั้น คัพภะที่อยู่ในระยะรูปร่างกลม (globular stage) ประกอบด้วยเซลล์ 50 เซลล์ เป็นคัพภะขนาดเล็กที่สามารถแยกและนำมาเพาะเลี้ยงให้ เจริญเติบโตได้ ความพยายามที่จะแยกเอาไซโกต (zygote) ของพืชชั้นสูงและเพาะเลี้ยงให้เจริญเปลี่ยนแปลงไปเป็นคัพภะในหลอดแล้วนั้นยังไม่สำเร็จ

เมื่อนำคัพภะที่เจริญเต็มที่แล้วแต่มีขนาดเล็กกว่าปกติไปเลี้ยงในอาหาร สังเคราะห์ คัพภะสามารถเจริญเติบโตได้ในทางตรงข้ามคัพภะที่ยังไม่มีการเปลี่ยนแปลงไป เป็นส่วนต่าง ๆ นั้นมี ความต้องการอาหารมากขึ้น อาจต้องเติมอาหารเสริม เช่น น้ำมะพร้าว ในบางกรณีก็ต้องให้ความเข้มข้นของน้ำตาลซูโครสเพิ่มเป็น 8 - 12 % การให้ฮอร์โมนพวกออกซินและไซโตไคนินในปริมาณที่เหมาะสมก็ช่วยให้คัพภะเจริญ ได้ดีขึ้น

5. การเพาะเลี้ยงรังไข่ (Ovary culture)

การเพาะเลี้ยงรังไข่ได้รับความสำเร็จในพืชบางชนิด ซึ่งมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาของรังไข่แบบง่าย ๆ และผลแก่เร็ว ผลที่เกิดจากการเพาะเลี้ยงรังไข่จะมีขนาดเล็กกว่าผลที่เจริญมาจากต้นโดยตรง การเจริญของรังไข่ก็คล้ายคลึงกับรังไข่ที่เจริญอยู่บนต้น ผลที่สุดก็ไม่มีลักษณะที่ผิดปกติ การเพาะเลี้ยงรังไข่ซึ่งได้รับการผสมแล้ว จะมีเมล็ดที่สมบูรณ์ซึ่งสามารถเจริญเติบโตได้ แต่จะมีจำนวนของเมล็ดน้อยกว่าผลที่แก่จากต้น

จุดมุ่งหมายของการเพาะเลี้ยงรังไข่ส่วนใหญ่ก็เพื่อศึกษาการเกิดผลประโยชน์ ที่น่าสนใจของการเพาะเลี้ยงรังไข่อีกอย่างหนึ่งก็คือในแง่ของการผสมพันธุ์ พืช เนื่องจากการผสมพันธุ์พืชบางชนิดผลมักจะร่วงไปก่อนที่จะแก่เต็มที่ ดังนั้นถ้านำเอารังไข่ที่ผสมแล้วมาเพาะเลี้ยงก็แน่ใจว่า จะได้เมล็ด

ความต้องการสำหรับการเลี้ยงรังไข่ การเลี้ยงรังไข่ควรดึงเอากลีบเลี้ยงออกเสียก่อนจะช่วยให้การเจริญของรังไข่ดีขึ้น สำหรับรังไข่ที่เอามาจากดอกซึ่งได้รับการผสมแล้ว 2 - 3 วัน อาหารที่ใช้เลี้ยงไม่ต้องใส่ฮอร์โมน ตรงข้ามกับรังไข่ที่เอามาจากดอกที่ไม่ได้รับการผสมต้องให้ออกซิน และบางกรณีให้ไซโตไคนินหรือจิบเบอเรนลินหรือทั้ง 2 อย่าง

6. การเพาะเลี้ยงโอวูล (Ovule culture)

การเพาะเลี้ยงโอวูลได้ดัดแปลงมาเพื่อใช้เลี้ยงคัพภะ ซึ่งจะเพาะเลี้ยงโอวูลก่อนที่จะเกิดมีคัพภะในขนาดที่เหมาะสม จนกว่าคัพภะมีขนาดโตพอที่สามารถแยกและเพาะเลี้ยงได้ โอวูลสามารถแยกมาเพาะเลี้ยงได้หลังจากเกิดการถ่ายละอองเกสรแล้ว 2 - 3 วัน แต่ไซโกต ยังไม่แบ่งตัว

7. การเพาะเลี้ยงตาดอก (Flower bud culture)

เป็นประโยชน์ในการศึกษาว่าสภาวะแวดล้อมที่สามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงไป เป็นส่วนต่าง ๆ ของดอก เช่น เกสรตัวผู้ เกสรตัวเมีย กลีบดอกและส่วนอื่น ๆ ได้อย่างไร นอกจากนั้นยังเป็นประโยชน์ในการศึกษาเกี่ยวกับการกำหนดเพศ (sex expression) และ ปรากฏการณ์ของการสืบพันธุ์อื่น ๆ

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อให้ออกดอกในหลอดแล้วอาจทำได้ 3 วิธี คือ

ก. ตัดตาดอกนำไปเพาะเลี้ยงโดยตรง

ข. กระตุ้นให้ปลายยอดที่เลี้ยงออกดอก

ค. ดอกเกิดจากส่วนอื่น ๆ ที่นำไปเพาะเลี้ยง เช่น ลำต้น ใบ รากและส่วนอื่น ๆ

วิธีการดูแลรักษาพืชในสภาพขวดแก้ว

สภาพแวดล้อม สิ่งแวดล้อมที่สำคัญในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ แสง และอุณหภูมิ ส่วนความชื้นนั้นถูกควบคุมอยู่แล้วเมื่อเลี้ยงในสภาพหลอดแก้ว การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโดยมากจะเลี้ยงที่อุณหภูมิประมาณ 20 - 25 ๐ ซ ใช้แสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์ โดยให้มีความเข้มข้นของแสงประมาณ 3,000 ลักซ์ แสงเท่านี้ก็เพียงพอในการให้พืชเจริญอยู่ได้ปกติ แต่ไม่เพียงพอต่อการสังเคราะห์แสงซึ่งไม่จำเป็นในระยะนี้เนื่องจากมีน้ำตาลอยู่ในอาหารแล้ว ช่วงแสงให้ประมาณ 12 - 16 ชั่วโมง บางครั้งให้ได้รับแสงตลอด 24 ชั่วโมง

นอกจากนีเมื่อเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เลี้ยงทั้งบนอาหารกึ่งแข็งหรือในอาหาร เหลวจะต้องมีการถ่ายเนื้อเยื่อลงอาหารใหม่ตามเวลาอันเหมาะสม การเลี้ยงเนื้อเยื่อไว้ในอาหารเดิมนาน ๆ จะทำให้เกิดภาวะขาดธาตุอาหารและมีของเสียที่เนื้อเยื่อถ่ายออกมาสะสมอยู่ เป็นผลให้เนื้อเยื่อหยุดเจริญเติบโตและตายได้ โดยทั่วไปจะต้องถ่ายเนื้อเยื่อที่เลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งทุก 4 - 6 สัปดาห์ และที่เลี้ยงในอาหารเหลว ทุก 2 - 4 สัปดาห์ แล้วแต่ชนิดของพืช การถ่ายเนื้อเยื่อในระยะแรกควรนำเนื้อเยื่อที่ได้ทั้งหมดถ่ายลงอาหารใหม่จน กระทั่งได้เนื้อเยื่อที่อยู่ในสภาพที่แข็งแรงสมบูรณ์ ในระยะต่อมาจึงถ่ายเนื้อเยื่อเฉพาะบางส่วนที่สมบูรณ์ที่สุดและ ชิ้นส่วนพอเหมาะ ถ้าชิ้นส่วนเนื้อเยื่อเล็กมากเกินไปจะทำให้เนื้อเยื่อมีโอกาสรอดน้อย แสงสว่างมีส่วนช่วยให้เนื้อเยื่อเจริญเติบโตได้เร็วขึ้น สิ่งสำคัญที่ต้องระวังในการถ่ายเนื้อเยื่อจะต้องใช้เทคนิคที่ปราศจากเชื้อ

การเพิ่มปริมาณเนื้อเยื่อพืช

เมื่อ เนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนพืชตั้งตัวได้ในสภาพปลอดเชื้อ จุดประสงค์ต่อไป คือ การเพิ่มจำนวนของยอด พืชบางชนิดจะเกิดรากในอาหารพื้นฐานเช่นเดียวกับกิ่งปักชำเล็ก ๆ ซึ่งเป็นสิ่งที่ไม่ต้องการเนื่องจากว่าควรมีการเจริญเพิ่มปริมาณยอดก่อน พืชบางชนิดผลิตยอดจำนวนมากโดยไม่ใช้สารควบคุมการเจริญเติบโต ดังนั้นการใช้อาหารจึงควรพิจารณาระดับของสารควบคุมการเจริญเติบโตที่พืช ต้องการ ลักษณะของการเพิ่มจำนวน การทำให้แตกยอดจำนวนมากทำได้หลายวิธี

- ปลายยอดมีการเจริญยืดยาวเป็นข้อและปล้อง ตัดแต่ละข้อไปขยายพันธุ์ได้

- ตาข้างผลิตยอด ยอดดังกล่าวผลิตจากตาบริเวณซอกใบ ทำให้ได้ยอดจำนวนมาก

- พืชหลายชนิดสร้างราก ยอด หัวจากชิ้นส่วนพืชซึ่งปกติไม่สร้างอวัยวะดังกล่าววิธีการนี้เรียกว่า organogenesis เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพกว่า 2 แบบแรก ตัวอย่าง เช่น ใบ 1 ใบ สามารถผลิตตาและยอดใหม่ได้เป็นจำนวนมาก แต่ละต้นจะมีลักษณะเหมือนต้นแม่ทุกประการ

- การสร้างเอ็มบริออยด์ (somatic embryogenesis) เป็นวิธีที่มีศักยภาพมากที่สุดในการขยายพันธุ์ โดยขั้นแรกเซลล์เดี่ยวจะผลิตเอ็มบริออยด์ และพัฒนาไปเป็นต้น การสร้าง เอ็มบิรออยด์เกิดได้ทั้งในเซลล์แขวนลอยหรือการเลี้ยงแคลลัส การชักนำให้เกิดเป็นเอ็มบริออยด์ต้องใช้อาหารที่มีไนโตรเจนต่ำกว่าปกติ

โดยทั่ว ๆ ไปอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงปกติแล้ว การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อชักนำการเกิดยอด (shoot initiation) และเพิ่มจำนวนยอด (shoot multiplication) สามารถใช้อาหารที่มีส่วนประกอบหรืออาจใช้สูตรอาหารที่ใกล้เคียงกันได้ แต่เนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนมีความต้องการกระตุ้นจาก สารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกต่างกัน พืชส่วนมากเปลี่ยนแปลงพัฒนาเป็นอวัยวะถ้าได้รับ สารควบคุมการเจริญเติบโต 2 กลุ่ม คือ ออกซิน และ ไซโตไคนิน ทั้งนี้ผันแปรขึ้นกับชนิดของพืช ระยะการเจริญเติบโตของชิ้นส่วน และระดับหรือสัดส่วนของสารควบคุมการเจริญเติบโต ทั้ง 2 ชนิดที่ใช้ในสูตรอาหาร มีข้อสังเกตสำคัญคือ

- ถ้าสัดส่วนของไซโตไคนินต่อออกซินสูงขึ้น (ไซโตไคนิน > ออกซิน) จะกระตุ้นการเกิดยอด (shoot formation)

- ถ้าสัดส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินสูงขึ้น (ออกซิน >ไซโตไคนิน) จะกระตุ้นการเกิดราก (root induction)

อย่างไรก็ตามในกรณีการสร้างยอดและกระตุ้นการแตกกิ่งข้าง สารควบคุมการ- เจริญเติบโตทั้ง 2 ชนิดนี้จะต้องมีอยู่ในอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง ยกเว้นในพืชบางชนิดที่อาจต้องการไซโตไคนินเพียงอย่างเดียวเท่านั้น ในทางปฏิบัติต้องมีการทดสอบหาสัดส่วนของสารควบคุมการ-เจริญเติบโตที่เหมาะสม

นอกจากนี้หลังจากผลิตยอดได้จำนวนมากพอแล้ว จำเป็นต้องให้ยอดเหล่านี้ได้รับสภาพที่เหมาะสมเพื่อเกิดการยืดตัวของยอด โดยเลี้ยงบนอาหารที่ไม่มีสารควบคุมการเจริญเติบโต การเติมจิบเบอเรลลินในอาหารมีผลช่วยทำให้ปล้องยืดยาวขึ้นได้ ถ้ายอดมีการผลิตได้มีปล้อง ยาวพอแล้วก็ไม่จำเป็นต้องผ่านขั้นตอนนี้

จำนวนพืชที่ผลิตได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จะแตกต่างไปตามสภาพที่เลี้ยง และ ชนิดของพืช ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนพืชเพียงชิ้นเดียวต่อปี ขึ้นอยู่กับอัตราการขยายพันธุ์และจำนวนครั้งที่มีการถ่ายเนื้อเยื่อ

คิดอัตราการทวีคูณจำนวนต้นสามารถคำนวณได้

เมื่อทราบสิ่งสำคัญ 2 ประการ คือ

1. อัตราการขยายพันธุ์ (ยอดต่อชิ้นส่วน)

2. ระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อ (สัปดาห์ต่อครั้ง)

การคำนวณจำนวนต้นที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

จำนวนต้นกล้าที่สามารถทำการเพาะเลี้ยงได้ภายในระยะเวลา 1 ปี

= อัตรการขยายพันธุ์{[52-ระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อ(จำนวนสัปดาห์ต่อครั้ง)]/ระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อ}

(จำนวนยอดต่อชิ้นส่วน)

ตัวอย่าง

สมมุติเบญจมาศมีอัตราการขยายพันธุ์โดยเกิดยอดได้ 10 ยอดต่อชิ้นส่วน และมีระยะเวลาในการย้ายถ่ายเนื้อเยื่อคือ 4 สัปดาห์ต่อครั้ง

ดังนั้นปริมาณต้นที่ได้ในระยะเวลา 1 ปี

= 10 {[52-4]/4} = 1012 =1,000,000,000,000 ต้น

เมื่อคิดเพียง 6 เดือน จะมีจำนวนต้น = 10[12/2] = 106 = 1,000,000 ต้น

ปัจจัยที่มีผลต่อการเพิ่มจำนวนต้น

อาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง (media used)

การเพาะเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนยอดสามารถใช้อาหารที่มี ส่วนประกอบของเกลือสูตร MS-salts ได้ผลดีและอาจใช้สูตรอาหารที่ใกล้เคียงกันได้ แต่ที่สำคัญต้องประกอบด้วย เกลืออนินทรีย์ MS-inorganic salts, 170 มก/ล. NaH2PO4.H20 80 มก/ล. adenine sulphate dihydrate, 0.4 มก/ล. thiamine HCl, 100 มก/ล. inositol และ 3 % ซูโครส ซึ่งใช้ได้ผลดีกับพืชแทบทุกชนิด อย่างไรก็ตามในบางพืชความเข้มข้นของเกลือดังกล่าวอาจสูงเกินไปหรือสูงเกินความจำเป็น ความต้องการสารกระตุ้นการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อผันแปรขึ้นกับระบบที่ใช้ใน การเพาะเลี้ยง และวิธีการขยายหรือเพิ่มจำนวนยอด

ฮอร์โมน (hormones)

พืชส่วนมากเปลี่ยนแปลงพัฒนาเป็นอวัยวะถ้าได้รับฮอร์โมน 2 กลุ่ม คือ ออกซิน และไซโตไคนิน ทั้งนี้ผันแปรขึ้นกับชนิดพืช ระยะการเจริญเติบโตของชิ้นส่วนพืช และระดับหรือสัดส่วนของฮอร์โมนทั้ง 2 ชนิด ที่ใช้ในสูตรอาหาร ซึ่งมีข้อสังเกตสำคัญคือ

- ถ้าสัดส่วนของไซโตไคนินต่อออกซินสูงขึ้น (ไซโตไคนิน > ออกซิน) จะกระตุ้นการเกิดยอด (shoot formation)

- ถ้าสัดส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินสูงขึ้น (ออกซิน > ไซโตไคนิน) จะกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงพัฒนาเพื่อกำเนิดราก (root differentiation)

อย่างไรก็ตามในกรณีการสร้างยอด (adventitious shoot formation) และกระตุ้น การแตกกิ่งข้าง (enhanced axillary branching) ฮอร์โมนทั้ง 2 ชนิด นี้จะต้องมีอยู่ในอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง ยกเว้นในพืชบางชนิดที่อาจต้องการไซโตไคนินเพียงอย่างเดียวเท่านั้น

แสงและอุณหภูมิ (light and temperature)

แม้ว่าโดยปกติแล้วการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชในอาหารสังเคราะห์จะไม่พึ่ง การสังเคราะห์แสงมากนัก แสงก็ยังมีความจำเป็นต่อกระบวนการเปลี่ยนแปลงพัฒนาทางด้านสัณฐานที่ถูกควบคุมด้วยพันธุกรรม โดยทั่ว ๆ ไปแล้วต้องการความเข้มแสงในช่วง 1,000 - 5,000 ลักซ์ ทั้งนี้ขึ้นกับชนิดของพืชด้วย ตัวอย่าง ยอดของเยอบีรา และไม้ดอกล้มลุกหลายชนิด ต้องการความเข้มแสงอย่างต่ำประมาณ 3,000 ลักซ์ และที่เหมาะสมที่สุดคือประมาณ 1,000 ลักซ์ ถ้าความเข้มแสงสูงเกิน 3,000 ลักซ์ จะมีผลในทางยับยั้งได้ สำหรับความยาวนานของช่วงแสง (photoperiod) กล่าวได้ว่าไม่ค่อยมีข้อจำกัด และนิยมใช้แสงนาน 16/8 ชั่วโมง กลางวัน/กลางคืน สำหรับอุณหภูมิคงที่ 25 ๐ ซ นิยมใช้มากที่สุด แม้ว่าในพืชบางชนิดอาจได้ผลดีกว่าหากใช้อุณหภูมิสลับที่สูงหรือต่ำกว่านี้ก็ตาม

อาการฉ่ำน้ำ (vitrification หรือ hyperhydricity)

บางครั้งอาจเกิดขึ้นได้ ถ้าหากมีการย้ายเนื้อเยื่อบ่อยครั้ง ซึ่งจะทำให้เนื้อเยื่อ ลดความแข็งแรง และผ่าเหล่าง่าย ดังนั้นในการขยายพันธุ์จึงควรรักษาแม่พันธุ์ไว้โดยที่ไม่ ย้ายเปลี่ยนอาหารบ่อยครั้ง และการย้ายเปลี่ยนอาหารบ่อยครั้งยังทำให้เกิดรากมากขึ้นด้วย

วิธีการชักนำราก

หลังจากที่ได้จำนวนยอดตามต้องการแล้ว ระยะต่อไปคือ การชักนำให้ยอดเกิดรากในสภาพหลอดแก้วหรือโดยการปักชำธรรมดา สำหรับพืชที่ออกรากง่าย การย้ายออกสู่ภายนอกเพื่อให้ออกรากจะประหยัดกว่า เพราะไม่ต้องเสียค่าใช้จ่ายในการเตรียมอาหารเพิ่มและไม่ต้องทำงานภายใต้สภาพปลอดเชื้อ ถ้าเป็นพืชที่ออกรากยากควรให้ออกรากในอาหารที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตก่อนย้ายออกปลูก

การให้พืชออกรากภายนอกหลอดแก้วหรือขวด จะต้องจัดสภาพการเลี้ยงดูให้เหมาะสมควรให้ความชื้นสูงเพื่อป้องกันการแห้ง เหี่ยวของพืช อาจจุ่มกิ่งพืชขนาดเล็กที่ผลิตได้ให้ออกรากได้ในออกซินชนิดผง หรือชนิดน้ำเหมือนการปักชำกิ่งธรรมดา ข้อดีของการให้กิ่งพืชออกราก ภายนอกคือ ปกติรากที่สร้างในสภาพหลอดแก้ว จะได้รับการปรับสภาพให้เหมาะสมกับสภาพน้ำหรืออาหารที่ได้รับ แต่ไม่ได้ปรับตัวให้เข้ากับสภาพดิน ดังนั้นรากเหล่านี้อาจทำงานไม่ดีในสภาพดินปลูก และจะต้องสร้างรากใหม่ที่ปรับสภาพได้ในดินขึ้นมาแทนหลังย้ายลงดิน การย้ายลงดินเพื่อให้ออกรากทำให้พืชไม่เสียพลังงานในการสร้างรากชนิดใหม่ ในพืชบางชนิดจะเห็นรากฝอยเกิดขึ้นในระยะที่มีการเพิ่มจำนวนต้น บางชนิดสามารถสร้างรากได้ในอาหารที่ไม่มีไซโตไคนิน บางชนิดก็ต้องการสารควบคุมการเจริญเติบโตในการสร้างราก ทั้งนี้พืชแต่ละชนิดต้องการสภาพการเลี้ยง ส่วนประกอบของอาหาร และระดับของสารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกต่างกันไป เช่นเดียวกับระยะอื่นของการขยายพันธุ์ในสภาพปลอดเชื้อ ปัจจัยต่าง ๆ เช่น pH และแสง เป็นต้นมีผลเกี่ยวข้อง การปรับสภาพของต้นพืชขนาดเล็กที่ผลิตได้ก่อนที่จะย้ายลงไปยังอาหารที่ออก รากก็ช่วยส่งเสริมการเกิดรากได้ เช่น การให้แสงหรือการให้ความเย็น การปรับสภาพ ดังกล่าวก็ช่วยส่งเสริมการเกิดรากได้เช่นกัน

วิธีการนำต้นออกปลูก

การ ให้พืชออกรากภายในหรือภายนอกหลอดแก้วก็ตาม เมื่อนำพืชออกมาสู่สภาพ ภายนอกนั้น ต้นพืชต้องเผชิญกับสิ่งแวดล้อมใหม่ และจะเครียดถ้าไม่มีการเตรียมป้องกันระยะนี้เป็นระยะวิกฤตที่สุดในการขยาย พันธุ์พืชในสภาพปลอดเชื้อ อัตราการตายของต้นพืชสูงมากถ้าการจัดการไม่ดีพอ เนื่องจากในสภาพหลอดแก้วพืชได้รับความชื้นสูง ไม่มีเชื้อปนเปื้อน ได้รับอาหาร และความเข้มของแสงที่เหมาะสม ดังนั้นจึงต้องได้พืชปรับตัวที่ละน้อยก่อนย้าย ออกปลูก เพราะถ้าพืชพบสภาพที่เปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วจะตายได้ ตัวอย่างเช่น ใบที่ผลิตในสภาพหลอดแก้วภายใต้ความชื้นสูงและคายน้ำต่ำ จะมีชั้นของคิวติเคิล (cuticle) ที่บางและ ปากใบเปิดมาก และการเลี้ยงในสภาพความเข้มของแสงต่ำ ทำให้มีการสร้างคลอโรฟิลล์ต่ำ การให้พืชปรับตัวเช่น การลดความชื้นในขวดโดยการคลายฝาขวด การเพิ่มปริมาณวุ้น การลดปริมาณน้ำตาล และการเพิ่มความเข้มของแสงให้สัปดาห์ก่อนหน้าที่จะมีการย้ายออกปลูก อาจช่วยให้เกิดการสร้างคลอโรฟิลล์เพิ่มขึ้นทำให้การสังเคราะห์แสงเพิ่มขึ้น การดูแลกิ่งพืชที่ย้ายออกมาจากหลอดแก้ว จะเหมือนกับการดูแลกิ่งอ่อนปักชำ ซึ่งจะต้องให้ได้รับความชื้นสูงและความเข้มของแสงต่ำในตอนแรก แล้วจึงเริ่มเพิ่มความเข้มของแสง และลดความชื้นใน สัปดาห์ต่อมา เครื่องปลูกที่ใช้ในการชำนั้นควรเก็บความชื้นได้ดี และมีการระบายน้ำดี ดินที่ใช้ ไม่จำเป็นต้องฆ่าเชื้อ แต่ควรระวังเรื่องความสะอาดให้มากภายใต้สภาพความชื้นสูง