-การเตรียมชิ้นส่วนพืช

การเตรียมชิ้นส่วนพืช

อิทธิพลของสภาพเนื้อเยื่อก่อนเพาะเลี้ยง (Pre-conditioning effects)

สภาพของเนื้อเยื่อพืชก่อนนำมาเพาะเลี้ยงอาจมีผลเช่นกัน สภาพเหล่านี้ได้แก่

1. ฤดูกาล

- ฤดูกาล ซึ่งจะมีช่วงแสง อุณหภูมิ และปัจจัยสภาพแวดล้อมอื่น ๆ ที่แตกต่างกันในการเพาะเลี้ยงยาสูบปัจจัยเหล่านี้จะมีผลต่อการเกิดอวัยวะ

- ช่วงเวลาการดูแลรักษา ตลอดจนปุ๋ย และสารเคมีที่ใช้

- แม้กระทั่งตำแหน่งของเนื้อเยื่อที่แยกออกมาจากต้นในแต่ละฤดูกาลมาใช้ก็มีผลเช่นเดียวกัน

2. ธาตุอาหาร

สภาพความอุดมสมบูรณ์ของดิน และธาตุอาหารที่พืชได้รับ อาจมีผลต่อความแข็งแรง สุขภาพ และศักยภาพของเนื้อเยื่อที่นำมาใช้ โดยเฉพาะการใส่ปุ๋ยในช่วงก่อนแยกเอาเนื้อเยื่อมาใช้ อาจมีผลทำให้การตอบสนองของเนื้อเยื่อเปลี่ยนแปลงได้

3. แสง

การเปลี่ยนแปลงสภาพความเข้มแสงที่พืชได้รับ อาจทำให้การตอบสนองของเนื้อเยื่อและเซลล์พืชเปลี่ยนแปลงไปได้ ตัวอย่างในยาสูบ ความเข้มข้นแสงที่เพิ่มมากขึ้นทำให้มีการตอบสนองต่อการเพาะเลี้ยงเพิ่มขึ้น ขณะที่การเพาะเลี้ยงเซลล์พืชบางชนิด โดยเฉพาะ โพรโทพลาสมีความต้องการแสงน้อยลงหรือต้องการสภาพมืด

4. สารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช

การให้สารกระตุ้นการเจริญเติบโตก่อนแยกเนื้อเยื่อพืชมาใช้ มักช่วยกระตุ้นการตอบสนองให้ดีขึ้น ตัวอย่างใช้กรดจิบเบอเรลลิก (GA3) เพื่อชักนำให้เกิด juvenile tissues ที่ง่ายต่อการเพาะเลี้ยงในยาสูบ และส้ม หรือใช้สารชะลอการเจริญเติบโต (growth retardants) เช่น CCC (B-chloroethyl-trimethyl ammonium chloride) ในใบมะเขือเทศ ทำให้ความแข็งแรงของเนื้อเยื่อลดลง

5. การปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์

การลดปริมาณจุลินทรีย์ในเนื้อเยื่อพืชที่เพาะเลี้ยง โดยใช้สารเคมีต่าง ๆ สารกำจัดเชื้อรา (fungicides) สารปฏิชีวนะ (antibiotics) เพื่อกำจัดเชื้อแบคทีเรีย สารกำจัดไวรัส (antiviral agents เช่น virozol) การใช้ความร้อน (heating) หรือการอบแห้ง (drying out) อาจทำให้ความชีวิตและความแข็งแรงของเนื้อเยื่อลดลงได้

โดยปกติแล้ว พืชทีปลูกในเรือนควบคุมสภาพแวดล้อม (growth chamber หรือ controlled room) มักให้ชิ้นส่วนพืชที่สะอาดและปลอดโรค จึงเหมาะต่อการใช้เพาะเลี้ยงมากกว่าพืชที่ปลูกในเรือนปลูกพืชทดลอง หรือในสภาพไร่ ซึ่งยากต่อการหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนจาก จุลินทรีย์และเชื้อโรค

การเลือกชิ้นส่วน

ขนาด ของเนื้อเยื่อ โดยเนื้อเยื่อที่มีขนาดใหญ่จะง่ายต่อการปนเปื้อนจากจุลินทรีย์และเชื้อโรค ต่าง ๆ ขณะที่เนื้อเยื่อขนาดเล็กมีโอกาสหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนได้ดีขึ้น อย่างไรก็ตาม ขนาดของเนื้อเยื่อที่เล็กที่สุดที่มีประสิทธิภาพ เป็นสิ่งที่ควรพิจารณา เนื่องจากเนื้อเยื่อเจริญที่มีขนาดเล็กเกินไปอาจโตช้า และไม่ตอบสนองต่อการเพาะเลี้ยงเท่าเนื้อเยื่อที่มีขนาดใหญ่ หากเกิดสภาพเครียดหรือซ็อคจากการแยก ในทางปฏิบัตินิยมแก้ไขโดยเลี้ยงเนื้อเยื่อขนาดเล็กหลาย ๆ ชิ้นในภาชนะ (ขวด) เดียวกัน เพื่อกระตุ้นให้มีการตอบสนองต่อการเพาะเลี้ยงมากขึ้นแต่อาจเกิดปัญหาอิทธิ ผลของชิ้นส่วนจากแคลลัสที่โตเร็วกว่าการเลี้ยงเนื้อเยื่อเพียงชิ้นเดียวมาก ทำให้ต้องย้ายเนื้อเยื่อและเปลี่ยนอาหารบ่อยครั้งขึ้น ซึ่งเป็นการสิ้นเปลืองทั้งเวลา แรงงาน และค่าใช้จ่าย ทั้งยังเพิ่มความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนมากขึ้นด้วย

1. การเลือกต้นแม่พันธุ์ ควรพิจารณาดังนี้

1.1 พันธุ์ นอกจากการเลือกชนิดพืชที่ต้องการแล้ว นิสัยของพืชที่เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ง่าย หรือมีการสร้างรากง่ายขึ้นอยู่กับพันธุกรรม ถ้าเป็นไปได้ควรเลือกหลายพันธุ์ เนื่องจากบางพันธุ์อาจขยายพันธุ์โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อง่ายกว่าพันธุ์อื่น โดยทั่วไปพืชที่ขยายพันธุ์ง่ายด้วยวิธีการปักชำ มักจะขยายพันธุ์ได้ง่ายโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

1.2 สภาพของต้นแม่พันธุ์ ชิ้นส่วนพืชที่เริ่มต้น ที่จะนำมาเลี้ยงควรมาจากต้นที่แข็งแรง จะทำได้สำเร็จมากกว่าการนำมาจากต้นที่อ่อนแอ

1.3 หลีกเลี่ยงเนื้อเยื่อที่ได้จากต้นแม่พันธุ์ที่เป็นโรค ควรเลือกเฉพาะเนื้อเยื่อที่สมบูรณ์แข็งแรงปลอดโรค

2. ชิ้นส่วนของพืช (explant)

ทุกส่วนของพืชที่ประกอบด้วยเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่สามารถนำมาทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ทั้งนั้น แต่ความสามารถในการเจริญเติบโตอาจแตกต่างกันเพราะเซลล์แต่ละชนิดมีความตื่นตัว (active) ไม่เท่ากัน เนื้อเยื่อพืชที่มีเซลล์ตื่นตัวมากที่สุดคือเนื้อเยื่อเจริญ ซึ่งพบได้ในส่วนต่าง ๆ ดังนี้

2.1 ส่วนปลายยอดของลำต้น (shoot apex) เป็นบริเวณที่เซลล์มีการแบ่งตัวมากที่สุด ส่วนนี้นับจากปลายยอดสุดลงมาไม่เกิน 5 มิลลิเมตร

2.2 ส่วนปลายราก (root apex) ถัดจากส่วนของหมวกราก ก็จะมีส่วนที่ประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญคล้ายกับส่วนของปลายยอด

2.3 เนื้อเยื่อเจริญในท่อลำเลียง (vascular cambium) เป็นเนื้อเยื่อเจริญที่พบในส่วนของลำต้นและราก ซึ่งอยู่ระหว่างกลุ่มของท่ออาหาร และท่อน้ำ

2.4 เนื้อเยื่อเจริญที่อยู่ระหว่างปล้อง (intercalary meristem) ซึ่งจะพบในพืชพวก ใบเลี้ยงเดี่ยว ทำหน้าที่ในการเพิ่มความยาวของปล้อง

นอกจากนี้มีเนื้อเยื่อส่วนอื่น ๆ ที่สามารถนำทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้มีดังนี้

- ส่วนของเปลือกชั้นใน (inner bark) ซึ่งส่วนนี้ประกอบด้วยเนื้อเยื่อของชั้น phloem และ cortex

- ส่วนไส้ (pith) เป็นส่วนที่ในใจกลางสุดของลำต้นซึ่งประกอบด้วยเซลล์พวก parenchyma

- ใบ (leaf) ในส่วนของใบมีเซลล์ของแผ่นใบที่เรียกว่า palisade parenchyma และ spongy parenchyma อยู่จำนวนมาก ซึ่งนิยมใช้สำหรับแยกโพรโทพลาสต์

- ดอก (flower) ส่วนของดอกส่วนใหญ่ประกอบด้วยเซลล์พวก parenchyma ยกเว้นในส่วนของก้านดอก (peduncle) และฐานรองดอก (receptacle) ซึ่งอาจมีเนื้อเยื่อเจริญอยู่ด้วยยกตัวอย่างในฐานรองดอกของเยอบีร่าและ เบญจมาศที่สามารถชักนำให้เกิดต้นได้ดี

- ผล (fruit) เนื้อเยื่อของผลส่วนใหญ่ประกอบด้วยเซลล์พวก parenchyma โดยเฉพาะอย่างยิ่งในผลสด (fleshy fruit) ชนิดที่ผลมีเปลือกหุ้มผลนิ่มทั้งผล มักมีเมล็ดมากมาย (berry) เช่น กล้วย มะละกอ ละมุด ส่วนผลมีผนังชั้นนอกของเปลือกหุ้มผล พัฒนามาจากฐานรองดอก เมื่อผลแก่ผนังนี้จะแข็งและเหนียวแน่น ภายในผลนิ่มทั้งผล (pepo) เช่น พืชตระกูลแตง เป็นต้น และผลที่มีเปลือกหนาคล้ายหนังและมีต่อมน้ำมันจำนวนมาก ข้างในผลแยกเป็นส่วนๆ ชัดเจน (hesperidium) เช่น พืชตระกูลส้ม เป็นต้น

- เมล็ด (seed) ในส่วนของเมล็ดซึ่งประกอบด้วยคัพภะ (embryo) ใบเลี้ยง (cotyledon) และ endosperm ทั้งสามส่วนนี้ให้ความสำเร็จสูงในการเพาะเลี้ยง

การฟอกฆ่าเชื้อชิ้นส่วน

เนื้อ เยื่อที่จะนำมาเพาะเลี้ยงจะต้องผ่านการฆ่าเชื้อเพื่อกำจัดเชื้อจุลินทรีย์ ที่อาจมีติดอยู่ที่บริเวณผิวของเนื้อเยื่อออกเสียก่อนด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (sterilizing agent) ซึ่งมีอยู่หลายชนิด การเลือกชนิดของน้ำยาฆ่าเชื้อและสภาวะที่เหมาะสมสำหรับเนื้อเยื่อพืชแต่ละ ชนิด เป็นสิ่งสำคัญที่ต้องคำนึงถึงซึ่งจะต้องทำการทดลองหา

สารเคมีที่นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการใช้คือ โซเดียมไฮโปคลอไรต์ (sodium hypochlorte) แคลเซียมไฮโปคลอไรต์ (calcium hypochlorite) ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (hydrogen peroxide) เป็นต้น

ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ใช้น้ำยาฟอกขาวที่ใช้ในบ้าน เช่น Clorox ผลิตภัณฑ์นี้มีโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 5.25 % อัตราที่ใช้ คือ 10-20 % สารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์จะทำงานได้ไม่ดีเมื่อมี pH มากกว่า 8 และจะมีประสิทธิภาพสูงที่สุดเมื่อสารละลายมี pH 6 และเพื่อให้การทำงานของคลอรีนมีประสิทธิภาพมากขึ้น ในการฆ่าเชื้อบริเวณผิวพืช ควรเติมสบู่เหลวเข้าไปในสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ เช่น Tween20 2 - 3 หยด ถ้าไม่มีสามารถใช้น้ำยาล้างจาน และในขณะที่ทำการฆ่าเชื้อบริเวณผิวพืช ต้องเขย่าสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ ตลอดเวลาหรืออาจวางบนเครื่องเขย่าได้ เวลาในการฆ่าเชื้อด้วยสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ขึ้นอยู่กับชนิดของพืช ว่าทนต่อสารละลายคลอรีน นานแค่ไหน ถ้ามีความทนทานมากก็ใช้เวลานานขึ้นได้

มีสารเคมีหลายชนิดและวิธีการต่างๆ ที่ใช้ในการทำความสะอาดให้ตัวอย่างพืช

ให้มีความปลอดเชื้อ ซึ่งผู้ทำการเพาะเลี้ยงต้องใช้ดุลยพินิจในการเลือกใช้ให้เกิดความเหมาะสม กับเนื้อเยื่อพืชและประสิทธิภาพที่จะได้รับ ซึ่งมีแนวทางในการเลือกใช้ ดังนี้

1. มีประสิทธิภาพดี ให้เปอร์เซ็นต์ความปลอดเชี้อสูง

2. ราคาไม่แพง และหาซื้อได้ง่าย

3. เตรียมได้ง่าย ไม่มีขั้นตอนที่ยุ่งยาก

4. ไม่เป็นอันตราย หรือมีอันตรายน้อยที่สุดต่อสิ่งมีชีวิตทั้งคนและชิ้นตัวอย่างพืช

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อตายอดและตาข้าง

ตายอดและตาข้างเป็นชิ้นส่วนที่มีเนื้อเยื่อเจริญ (meristemmatic tissue) ที่มี การตื่นตัว (active) อยู่ตลอดเวลา เหมาะแก่การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ซึ่งจะมีเปอร์เซ็นต์ ความสำเร็จสูง มีขั้นตอนดังนี้

1. ตัดเอาส่วนของยอดหรือตามาทำการแยกเอาใบและก้านใบออกให้หมด หรือถ้ามีใบเกล็ด ที่ห่อหุ้มตาอยู่ก็ให้แกะออกจนสังเกตเห็นส่วนของตา

2. แช่ในสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 10 % หรือสารละลายโซเดียม ไฮโปคลอไรต์ ความเข้มข้น 2 % เติม tween-20 ในอัตราส่วน 1 หยด ต่อสารละลาย 100 มิลลิลิตร หรือประมาณ 0.01 % เพื่อช่วยให้สารละลายจับกับผิวตัวอย่างได้ดี

3. ทำการเขย่าเป็นระยะ ๆ หรือวางไว้บนเครื่องเขย่าเป็นเวลาประมาณ 15 นาที

4. ล้างเอาสารละลายออกด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง ๆ ละประมาณ 5 นาที

5. ย้ายตัวอย่างไปวางผึ่งบนจานแก้วให้แห้งพอหมาด ๆ แล้วทำการตัดแต่งพืชตัวอย่าง เพื่อทำการเพาะเลี้ยงต่อไป

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อชิ้นส่วนของแผ่นใบ

ใบพืชเป็นอวัยวะที่ค่อนข้างจะบอบบางเนื่องจากประกอบด้วยเนื้อเยื่อเพียงไม่กี่ชั้นเซลล์ โอกาสที่เนื้อเยื่อจะตายหรือได้รับอันตราย จากสารเคมีที่ใช้ฟอกฆ่าเชื้อมีมาก จึงมีความจำเป็นที่ต้องระมัดระวังเป็นพิเศษ มีขั้นตอนดังนี้

1. เลือกใบพืชที่สมบูรณ์ มาทำความสะอาดด้วยน้ำสบู่ เพื่อขจัดคราบฝุ่นและเศษซากของแมลงที่อาจติดอยู่กับใบ และเป็นการช่วยลดแรงตึงผิวของใบด้วย

2. แช่ใบในสารละลายคลอร๊อกซ์ความเข้มข้น 5 % เวลาประมาณ 10 นาที โดยทำการเขย่าเป็นระยะ ๆ หรือวางบนเครื่องเขย่า

3. ล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที

4. ย้ายตัวอย่างลงในจานแก้ว เพื่อทำการตัดแต่งตัวอย่าง และทิ้งไว้ให้แห้ง พอหมาด ๆ จึงย้ายลงเลี้ยงในอาหาร

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดพืช

เมล็ดพืชเป็นอวัยวะที่มีความแข็งแรงทนทานกว่าส่วนอื่น ๆ สามารถทนต่อสารเคมีที่มีความเข้มข้นสูง ๆ ได้ดี จึงเป็นการสะดวกในการฟอกฆ่าเชื้อ ประกอบกับเนื้อเยื่อต่าง ๆ ที่อยู่ภายในเมล็ด คือ คัพภะ และใบเลี้ยง มีสภาพที่มีความปลอดเชื้อสูง จึงเหมาะแก่การใช้ในการเริ่มต้นการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

เนื่องจากเมล็ดพืชมีความแตกต่างกันมาก จึงมีเทคนิคการฟอกฆ่าเชื้อแตกต่างกันด้วยดังนี้

1. การฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดที่มีลักษณะแข็ง เช่น ถั่วต่าง ๆ หน่อไม้ฝรั่ง น้อยหน่า เป็นต้น มีขั้นตอนดังนี้

(1). แช่เมล็ดในแอลกอฮอล์ ความเข้มข้น 95 % นานประมาณ 5 นาที เพื่อการฆ่าเชื้อที่ติดมากับเมล็ด และช่วยขจัดคราบไขมันบริเวณผิวเมล็ด

(2). ถ่ายเอาแอลกอฮอล์ออก ผึ่งเมล็ดไว้ให้แห้ง

(3). แช่เมล็ดในสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 20 % เติม tween-20 ประมาณ 0.01 % ทิ้วไว้ประมาณ 20 นาที

(4). ทำการล้างเมล็ดด้วยน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที

(5). ย้ายเมล็ดลงเลี้ยงในอาหาร

2. การฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดที่มีความอ่อนนุ่มหรือเมล็ดที่ยังไม่แก่เต็มที่ (immature seed) มีขั้นตอนดังนี้

(1). ถ้าเมล็ดมีเยื่อห่อหุ้ม เช่น เมล็ดมะเขือเทศจะมีลักษณะคล้ายวุ้น หรือเมล็ดมะละกอที่มีผนังเมล็ดที่เป็นเยื่อใส ๆ และสารละลายเหลว ๆ ห่อหุ้มอยู่ ก็ให้ทำการกำจัดออกเสียก่อน เพราะสิ่งดังกล่าวเหล่านั้นเป็นตัวยับยั้งการงอกของเมล็ด

(2). แช่เมล็ดในสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 15 % เติม tween-20 ประมาณ 0.01 % ทิ้วไว้ประมาณ 15 นาที

(3). ทำการล้างเมล็ดด้วยน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที

(4). ย้ายเมล็ดลงเลี้ยงในอาหาร

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อของกิ่งไม้

ส่วนของกิ่งไม้ประกอบด้วยเนื้อเยื่อที่ยังมีชีวิตที่จะใช้ทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ ก็คือ กลุ่มเนื้อเยื่อของท่อลำเลียงอาหาร เนื้อเยื่อแคมเบียม และเนื้อเยื่อตรงใจกลางของ ลำต้น ซึ่งเนื้อเยื่อดังกล่าวอยู่ในส่วนภายในของกิ่งหรือลำต้น ซึ่งมีสภาพที่ปลอดเชื้ออยู่แล้ว ฉะนั้นการฟอกฆ่าเชื้อจึงทำเฉพาะผิวนอกเท่านั้น ซึ่งมีขั้นตอนดังนี้

1. นำส่วนของกิ่งหรือลำต้นมาลนไฟ หรือจุ่มแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 95 % ก่อนแล้วเผาไฟ ก็จะสามารถฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวของตัวอย่างได้

2. ใช้มีดผ่าและตัดแยกเอาเฉพาะเนื้อเยื่อที่ยังมีชีวิตอยู่ดังกล่าวข้างต้น ลงเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงได้เลย

ตัวอย่างการฟอกฆ่าเชื้ออับเรณู

การเพาะเลี้ยงอับเรณูมีวัตถุประสงค์เพื่อการผลิตพืชที่มีโครโมโซมชุดเดียว (haploid plant) จากเซลล์สร้างสปอร์ (microspore mother cell) ที่อยู่ภายในอับเรณู มีขั้นตอนดังนี้

1. เลือกดอกที่ยังตูม โดยที่กลีบเลี้ยงและกลีบดอกยังไม่กางออก มากทำการฉีดพ่นด้วยแอลกอฮอล์ ความเข้มข้น 70 % ทิ้วไว้ให้แห้งพอหมาด ๆ

2. แช่ดอกสารละลายคลอร๊อกซ์ ความเข้มข้น 10 % เติม tween-20 ประมาณ 1 - 2 หยด ทิ้งไว้ประมาณ 15 นาที โดยเขย่าเป็นระยะ ๆ

3. ล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง ๆ ละ ประมาณ 5 นาที

4. ย้ายดอกลงในจานแก้ว ผึ่งให้แห้งพอหมาด ๆ แล้วทำการแกะดอกแยกเอาเฉพาะอับเรณูลงเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยง