-การเพาะเลี้ยงแคลลัส

การเพาะเลี้ยงแคลลัส

แคลลัส (callus) หมายถึงเซลล์ที่อยู่รวมกันเป็นกลุ่ม และยังไม่มีการเปลี่ยนแปลงพัฒนาไปเป็นเนื้อเยื่อหรืออวัยวะชนิดต่าง ๆ ประกอบด้วยเซลล์พาเรนไคมาแต่เพียงอย่างเดียว มีขนาดไม่แน่นอน ภายในเซลล์มีแวคิวโอจำนวนมาก ส่วนใหญ่ไม่มีรงควัตถุ แต่อาจมีสีเขียวเนื่องจากมีคลอโรฟิลล์ (chlorophylls) สีเหลืองจากแคโรทีนอยด์ (carotenoids) และฟลาโวทีนอยด์ (flavonoids) หรือสีม่วงจากแอนโทไซยานิน (anthocyanins) ปริมาณและ ชนิดของรงควัตถุเหล่านี้ขึ้นอยู่กับชนิดของพืช ธาตุอาหาร และปัจจัยสภาพแวดล้อมของการเพาะเลี้ยงโดยเฉพาะอย่างยิ่งแสง

แคลลัสที่ได้จะมีรูปร่าง สี แตกต่างออกไป ขึ้นอยู่กับชนิดของพืชและอาหารที่เลี้ยง เช่น แคลลัสของมันสำปะหลัง จะเป็นแคลลัสที่ประกอบด้วยเซลล์ที่เกาะตัวกันหลวม ๆ สามารถหลุดได้ง่าย เรียกว่า soft & friable callus บางชนิด แคลลัสจะประกอบด้วยเซลล์ที่เกาะ ตัวกันแน่น หลุดได้ยาก เรียกว่า compact & hard callus โดยทั่วไปไม่ว่าแคลลัสจะอยู่ในที่มืดหรือมีแสง จะมีสีครีมหรือสีเหลืองอ่อน แต่บางชนิดก็อาจจะมีสีเขียว เนื่องจากมีคลอโรฟิลล์ บางชนิดมีสีส้มเนื่องจากมีแคโรทีนอย และบางชนิดมีสีม่วงแดงเนื่องจากมีแอนโทไซยานิน

ชิ้นส่วนพืชเกือบทุกชนิดจากอวัยวะต่าง ๆ สามารถนำมาชักนำให้เกิดแคลลัสได้ แต่โดยทั่วไปแล้วเปอร์เซ็นต์ความสำเร็จสูงในพืชใบเลี้ยงคู่ได้จากส่วน ของคัพภะ ใบเลี้ยง ส่วนที่อยู่เหนือใบเลี้ยง ปลายยอด ส่วนที่อยู่ใต้ใบเลี้ยง และราก ในพืชใบเลี้ยงเดี่ยวได้จากส่วนของคัพภะ ใบอ่อน ปลายยอด ดอกอ่อน และส่วนของเมล็ดที่เริ่มงอกจะให้ผลดีที่สุด เนื้อเยื่อพิเศษอื่น ๆ ของพืชที่สามารถนำมาชักนำให้เกิดแคลลัสได้เช่นกันคือ แคมเบียม คอร์เทค ไส้หรือแกนลำต้น ท่อลำเลียงอาหาร ไซเลนพาเรนไคมา และเอ็นโดสเปอร์ม

คำว่า การเจริญ หมายถึง การเพิ่มขนาดโดยถาวร เกิดจากการแบ่งเซลล์แล้วเพิ่มจำนวนเซลล์ การเจริญของแคลลัสในอาหารแข็งเห็นได้จากการที่มีก้อนโตขึ้น วิธีวัดการเจริญของแคลลัสทำได้หลายวิธี เช่น ชั่งน้ำหนักสด น้ำหนักแห้ง การนับจำนวนเซลล์ นิยมใช้วิธีชั่งน้ำหนักสด เนื่องจาก

1. สะดวก รวดเร็ว และง่ายต่อการติดตามน้ำหนักเนื่อเยื่อที่เพิ่มขึ้น

2. ไม่ต้องทำลายแคลลัส และสามารถนำแคลลัสกลับมาเลี้ยงในอาหารตามเดิม ถ้าชั่งในสภาพปลอดเชื้อ

วิธีทำคือ คีบแคลลัสออกจากภาชนะที่เลี้ยงวางบนกระดาษที่ปลอดเชื้อ แล้วนำไปชั่งในตู้ปลอดเชื้อ สามารถทราบน้ำหนักที่เพิ่มโดยเปรียบเทียบกันระหว่างน้ำหนักก่อนและหลังการเพาะเลี้ยง เมื่อชั่งเสร็จคีบแคลลัสไปเลี้ยงบนอาหารได้อีก

นอกจากนี้วัดการเจริญเติบโตดังกล่าวแล้ว ยังอาจใช้การหาค่าโปรตีนทั้งหมด (total protein) เป็นพารามิเตอร์ในการวัด แต่ไม่นิยมใช้กันมากนัก

ปัจจัยที่มีผลต่อการเพาะเลี้ยงแคลลัส

1. ขนาดและรูปร่าง (size and shape)

ของชิ้นส่วนพืชเริ่มต้นที่ใช้เลี้ยงแม้ไม่มีข้อจำกัดหรือข้อวิกฤต แต่ในพืชทั่วไปมักจำเป็นต้องใช้ชิ้นส่วนที่มีขนาดค่อนข้างเล็กแต่ไม่ถึงกับ เล็กจนเกินไป ซึ่งถ้าชิ้นส่วนมีขนาดเล็กว่านี้แล้วจะไม่สามารถชักนำการเกิดแคลลัสได้ ตัวอย่าง ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อท่อลำเลียงอาหารของ รากแครอท (Daucus carota) ที่มีน้ำหนักเพียง 3.8 มก. สามารเกิดแคลลัสได้ แต่ถ้าเป็นเนื้อเยื่อจากหัว (tuberous meristematic tissues) ของ Jesusalem artichoke แล้ว อาจมีขนาดเล็กเกินไปทั้งนี้เพราะเซลล์ของแครอทมีขนาดเล็กกว่า จึงมีเปอร์เซ็นต์ถูกทำลายหรือถูกกระทบกระเทือนขณะแยกเนื้อเยื่อน้อยกว่า

2. สารควบคุมการเจริญเติบโต (growth regulators)

โดยเฉพาะออกซินและไซโตไคนินซึ่งสัดส่วนของฮอร์โมนทั้ง 2 กลุ่มนี้มีผลโดยตรงต่อการเปลี่ยนแปลงพัฒนาของเซลล์ โดยทั่ว ๆ ไปแล้วถ้าสัดส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินสูง (ออกซิน>ไซโตไคนิน) แคลลัสจะพัฒนาไปเป็นราก ถ้าสัดส่วนนี้ต่ำ (ออกซิน <ไซโตไคนิน) จะพัฒนาไปเป็นยอดหรือต้น และหากสัดส่วนนี้สมดุล (ออกซิน = ไซโตไคนิน) จะพัฒนาไปเป็นแคลลัสต่อไป ความเข้มข้นที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อพืชต่าง ๆ นั้นพบว่า ออกซินจะอยู่ในช่วง 0.01 - 10.0 มก/ล. และไคเนตินซึ่งเป็นไซโตไคนินสังเคราะห์จะอยู่ในช่วง 0.1 - 10.0 มก/ล. ทั้งนี้ปริมาณและสัดส่วนของฮอร์โมนที่เหมาะสมต่อการเกิดแคลลัสจะขึ้นอยู่กับชนิดพืช ชนิดชิ้นส่วน และระยะการเจริญเติบโตของชิ้นส่วนพืชที่นำมาใช้

3. ธาตุอาหาร (nutrients)

นอกจากจะต้องการธาตุอาหารที่เป็นส่วนประกอบหลักทั่ว ๆ ไป ของสูตรอาหารที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อพืชแล้ว อาหารเสริมพวกกรดอะมิโนเช่น กลูตามิน แอสปาติน อาร์จินิน พิวรีน และไพริมิดิน สารพวกเคซินไฮโดรไลเซท สารสกัดจากมอลท์ ยีสต์ และน้ำมะพร้าว มีส่วนสำคัญในการกระตุ้นการเกิดแคลลัสในพืชบางชนิดด้วยเช่นกัน

4. แหล่งคาร์บอน (carbon sources)

ที่สำคัญได้แก่ น้ำตาลซูโครส และ/หรือ แซคคาโรส ความเข้มข้น 2 - 4 %

5. ปัจจัยสิ่งแวดล้อม (environmental factors)

โดยเฉพาะแสง ซึ่งต้องการความเข้มต่ำหรือไม่ใช้แสงเลย (เลี้ยงในที่มืด) อุณหภูมิที่เหมาะสมประมาณ 25 ๐ ซ นอกจากนี้ยังต้องการออกซิเจนเพื่อการหายใจของเซลล์ด้วย

6. สภาพอาหาร (media status)

แคลลัสที่เลี้ยงในอาหารแข็งหรือกึ่งแข็งมักเจริญเติบโตได้น้อยและช้ากว่าใน อาหารเหลว เนื่องจากมีพื้นที่ผิวสัมผัสกับอาหารได้น้อยกว่า และตำแหน่งที่ชิ้นส่วนแคลลัสสัมผัสกับอาหารจะมีสารที่เป็นของเสียจากเมตาโบ ลิซึม (metabolic wastes) ปลดปล่อยออกมาจากเซลล์ และมีผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์

ประโยชน์ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงแคลลัส

1. การขยายพันธุ์ (micropropagation) โดยชักนำให้เกิดเป็นต้นที่ปราศจากโรคจำนวนมาก

2. การผลิตโพรโทพลาส (protoplasts) แคลลัสเหมาะอย่างยิ่งในการนำไปย่อยผนังเซลล์ เนื่องจากมีสภาพปลอดเชื้ออยู่แล้วและเซลล์ยังไม่มีการเปลี่ยนเปลงพัฒนา

3. การผลิตสารเคมีที่ได้จากกระบวนการเมตาโบลิซึม (secondary metabolites) ซึ่งบางชนิดสามารถนำไปใช้ในทางการแพทย์และอุตสาหกรรมได้

4. ผลิตพืชที่มีโครโมโซมหลายชุด (polyploids) โดยใช้สารโคลซิซินชักนำ

5. การผลิตพืชทนทานหรือพืชต้านทาน (tolerant and resistant plants) เช่น ทนทานต่อสภาพดินเค็ม ดินเปรี้ยว อากาศร้อนและหนาว หรือต้านทานต่อสารเคมีป้องกันกำจัดศัตรูพืช ต้านทานต่อโรคและสารพิษที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส

6. การเก็บรักษาเชื้อพันธุกรรมพืช (cryopreservation)