วันอาทิตย์ที่ 24 กรกฎาคม พ.ศ. 2554

-การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์

การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์
เซลล์พืชต่างจากเซลล์สัตว์ตรงที่มีผนังเซลล์หนาแข็ง และภายในเซลล์มี โพรโทพลาสต์หรืออาจเรียกว่า โพรโทพลาสต์ คือ เซลล์ที่ไม่มีผนังเซลล์การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์ หมายถึง การเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ไม่มีผนังเซลล์ หลังจากนั้นโพรโทพลาสต์ที่เพาะเลี้ยงมีความสามารถสร้างผนังเซลล์ขึ้นมาใหม่แล้วมีการแบ่งเซลล์กลายเป็นแคลลัส และในที่สุดได้ต้นใหม่ขึ้นมาโดยปกติแล้วเซลล์พืชทุกชนิดนอกจากจะมีผนังเซลล์ที่เป็นเซลล์เมมเบรน (membrane cell) แล้ว ยังมีผนังอีกชั้นหนึ่งเรียกว่า cell wall ประกอบด้วยสารจำพวกเซลล์ลูโลส (cellulose) และเฮมิเซลล์ลูโลส (hemicellulose) ผนังเซลล์ของพืชทั้ง 2 ชนิดนี้เชื่อมติดกันด้วยชั้น middle lamile ซึ่งประกอบด้วยสารพวกเพคติน (pectin)

การแยกโพรโทพลาสต์

โดยทั่วไปแล้วการแยกโพรโทพลาสต์มีเทคนิคพื้นฐานที่พอจะกล่าวอย่างคร่าว ๆ ได้คือ
1. ทำให้ชิ้นส่วนพืชปลอดเชื้อ
2. ดึงเอพิเดอร์มิสชั้นล่างออกในกรณีที่เป็นใบ หรือตัดชิ้นส่วนพืชเป็นชิ้นเล็ก ๆ เพื่อให้เอ็นไซม์แทรกซึมเข้าไปได้ดี
3. ใช้เอ็นไซม์แยกผนังเซลล์
4. ทำให้โพรโทพลาสต์ที่ได้สะอาดปราศจากเอนไซม์ เศษเซลล์ต่าง ๆ
5. ย้ายโพรโทพลาสต์ไปยังอาหารและสภาวะเพาะเลี้ยงที่เหมาะสม
ไม่ว่าจะได้โพรโทพลาสต์มาจากแหล่งใดของพืชก็ตาม พบว่ามีลักษณะที่เหมือนกันอย่างหนึ่งคือ เปราะแตกง่าย ดังนั้นก่อนแยกโพรโทพลาสต์ออกจากผนังเซลล์ต้องทำให้ชิ้นส่วนพืช ความเสถียรของเซลล์ (stabilized) ในสารละลายที่ค่อนข้างเข้มข้นเล็กน้อย มิเช่นนั้นเมื่อผนังเซลล์ถูกย่อยสลายมักจะขยายขนาดอย่างรวดเร็ว ทำให้แตกระเบิดได้ เมื่อได้โพรโทพลาสต์ออกมาแล้วการจัดการในขั้นต่อไปต้องระมัดระวังตลอด เพราะการปราศจากผนังเซลล์ทำให้ โพรโทพลาสต์ไม่อาจทน เหมือนตอนที่ยังเป็นเซลล์พืชอยู่
การแยกโพรโทพลาสต์ทำได้โดยวิธีกลหรือการใช้เอ็นไซม์ ทั้งสองวิธีนี้เซลล์พืชจะต้องถูกพลาสโมไลซ์ก่อนโดยสารละลายน้ำตาล เช่น แมนนิทอล (mannitol) หรือชอร์บิทอล (sorbitor) น้ำตาล 2 ชนิดนี้ค่อนข้างเป็นที่นิยม เพราะเฉื่อยต่อกระบวนการเมแทบอลิซึมของเซลล์ (metabolically relatively inert) ส่วนน้ำตาลชนิดอื่น เช่น กลูโคส หรือซูโครส เซลล์ดูดไปใช้ และมีผลต่อเมแทบอลิซึม ซึ่งเป็นผลให้โพรโทพลาสต์เกิดความไม่คงที่ (instability) ในระหว่าง การเพาะเลี้ยง
โดยทั่วไปแล้วสารละลายที่ใช้แยกโพรโทพลาสต์ค่อนข้างเข้มข้นเล็กน้อย เมื่อเทียบกับของเหลวภายในเซลล์ (cell sap) ดังนั้นแรงดันออสโมติกที่เหมาะสมที่ใช้ในการแยกโพรโทพลาสต์จัดว่ามีความสำคัญและต้องหาในพืชแต่ละชนิด เนื่องจากพืชแต่ละชนิดใช้ แรงดันออสโมติกต่างกัน เช่น ต้นยาสูบ และ cowpea (Vigma sinensis) มักแยกโพรโทพลาสต์ในสารละลายที่มีน้ำตาลแมนนิทอล 13 %(w/v) หรือ 0.7 M ในขณะที่ crown gall callus ของต้น Virginia creeper ใช้น้ำตาลแมนนิทอล 11 % (w/v) เมื่อแยกโพรโทพลาสต์ออกมาแล้วพบว่าส่วนใหญ่มีรูปกลม ยกเว้น โพรโทพลาสต์ที่ได้ มาจากปมรากของพืชตระกูลถั่ว ถ้าโพรโทพลาสต์อยู่ในสภาพบวดของผนังเซลล์ จะหดบิดเบี้ยวเสียรูปกลมไป

วิธีการแยกโพรโทพลาสต์นั้นแบ่งออกได้เป็น 2 วิธีใหญ่ ๆ คือ

1. การแยกโดยวิธีกล (mechanical isolation)
วิธีนี้ทำให้เซลล์พืชเกิดเซลล์เหี่ยวก่อน จากนั้นจึงตัดชิ้นส่วนพืชด้วยของมีคม จะทำให้โพรโทพลาสต์หลุดออกมาตรงรอยตัด อาจช่วยให้การหลุดออกมาของโพรโทพลาสต์เร็วยิ่งขึ้นโดยการกดเบา ๆ หรือลดแรงดันออสโมติกของสารละลายที่ล้อมรอบชิ้นส่วนพืช ทำให้โพรโทพลาสต์เต่งขึ้นใหม่และดันหลุดออกมาจากรอยตัดได้ดีขึ้น วิธีนี้มีข้อจำกัดหลายอย่าง เช่น ได้ปริมาณโพรโทพลาสต์ออกมาน้อย เหมาะกับเซลล์ที่มีขนาดใหญ่ ซึ่งทำให้ โพรโทพลาสต์หดตัวได้ในขณะที่เกิดเซลล์เหี่ยว นอกจากนี้อาจทำความเสียหายให้กับสิ่งต่าง ๆ ภายในเซลล์ที่คมมีผ่านไป
วิธีการโดยนำเนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนพืชที่ต้องการ ใส่ลงในสารละลายน้ำตาล หรือเกลือของแคลเซียม/โปแตสเซียม ทำให้ได้โพรโทพลาสจาก 2 กรณี คือ
1) สารละลายที่ใช้มีความเข้มข้นสูงกว่าสารละลายภายในเซลล์ เพื่อให้โพรโทพลาสหดตัวออกมาจากผนังเซลล์ (plasmolysis) การแยกเอาโพรโทพลาสโดยวิธีนี้อาจทำได้โดย
ง ใช้ใบมีดที่คม และผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว ตัดแยกผนังเซลล์ออกจาก โพรโทพลาส ระวังไม่ให้โพรโทพลาสได้รับอันตราย
ง ใช้เข็มแท่งแก้ว (glass needle) เขี่ยแยกโพรโทพลาสใต้ กล้องจุลทรรศน์
2) สารละลายที่ใช้มีความเข้มข้นต่ำกว่าสารละลายภายในเซลล์ เพื่อให้เกิดการดูดน้ำเข้าไปภายในเซลล์ ทำให้เซลล์ขยายขนาดใหญ่ขึ้นและโพรโทพลาสพองตัวหลุดออกมาจากผนังเซลล์ตรงรอยแผลที่ถูกเปิดออกด้วยใบมีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
เมื่อได้โพรโทพลาสจำนวนมากพอ นำสารละลายที่มีโพรโทพลาสนี้ไปกรองด้วย ผ้ากรอง หรือตะแกรงที่มีรูขนาด 100 - 150 mm ทั้งนี้ขึ้นกับขนาดของโพรโทพลาสของ พืชแต่ละชนิด นำไปปั่นเหวี่ยง (centrifuge) ที่ความเร็วประมาณ 100 g แล้วดูดสารละลายด้านบนออกทิ้งด้วยปิเปต จะได้โพรโทพลาสที่แยกส่วนอยู่ด้านล่าง
แยกโพรโทพลาสต์โดยใช้ใบมีดตัดเนื้อเยื่อพืชที่พลาสโมไลซ์แล้ว เซลล์ที่ถูกมีดตัดผ่านจะมีโพรโทพลาสต์ไหลออกมา อาจช่วยโดยการใช้วิธีกดหรือบีบเบา ๆ นอกจากนี้การลดแรงดันออสโมซิสของสารละลายที่แช่เซลล์เหล่านี้ทำให้ โพรโทพลาสต์บวมดันหลุดออกมาตรงรอยตัดได้ง่าย วิธีนี้ได้โพรโทพลาสต์น้อยและเหมาะกับเนื้อเยื่อที่เซลล์ขนาดใหญ่

2. การแยกโดยใช้เอ็นไซม์ (enzymatic isolation)
ผนังเซลล์พืชถูกทำลายได้โดยพวกไฮโดรไลติกเอนไซม์ ผนังเซลล์ปฐมภูมิของ พืชชั้นสูงประกอบไปด้วยโครงร่างจากเซลลูโลส ซึ่งเป็นพอลิเมอร์สายยาวของโมเลกุลของกลูโคสที่จับกันด้วย b1-4 linkage เซลล์ที่ยังไม่ได้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ เช่น บริเวณที่มีการยืดตัวของรากอ่อนข้าวโพดมีปริมาณเซลลูโลสประมาณ 25 - 40 % ของน้ำหนักแห้งของผนังเซลล์
น้ำตาลโมโนแซ็กคาไรด์อย่างอื่น เช่น แมนโนส กาแล็กโทส และไซโลส จะเกิด พอลิเมอไรเชชัน กลายเป็นแมนแนน (mannan) กาแล็กแทน (galactan) และไซแลน (xylan) ซึ่งก่อให้เกิดสายสั้น ๆ ของเฮมิเซลลูโลสและมีปริมาณ 50 % สัดส่วนเหล่านี้ผันแปรไปตามระยะของดิฟเฟอเรนทิเอชันของเซลล์ และโดยทั่วไปปริมาณเซลลูโลสจะเพิ่มตามอายุพืช ส่วนพวก เฮมิเซลลูโลสโปรตีนและลิพิดจะลดลงหรือหายไป แต่พวกลิกนินซึ่งเป็นอะโรเมติกพอลิเมอร์ของ เฟนีลโพรเพน (phenylpropane) กับกรดคูมารีลิก (p-coumarylic acid) และกรดชินแนปปีลิก (sinapylic acid) อาจเพิ่มขึ้นในระหว่างที่มีเซลล์เกิดการเปลี่ยนแปลง
ชั้นที่อยู่ระหว่างเซลล์หรือมิดเดิลลาเมลลามีกรดเพกติก (pectic acid) ซึ่งประกอบด้วยสายยาวของกรดกาแล็กทูโรนิกเป็นองค์ประกอบส่วนใหญ่ กรดเพกติกมักเกิดในรูปของเกลือแคลเซียมและแมกนีเซียม ทำหน้าที่เชื่อมระหว่างเซลล์ที่อยู่ติดกัน
การที่ผนังเซลล์ปฐมภูมิมีองค์ประกอบทางเคมีหลายชนิดทำให้มีผลต่อความทนทาน ในการทำลายของเอ็นไซม์ต่าง ๆ จึงจำเป็นต้องมีการใช้คอมบิเนชัน (combination) ของเอ็นไซม์หลายชนิด ตลอดจนความเข้มข้นและเวลาในการอินคูเบต (incubate) ในเนื้อเยื่อแต่ละ อย่างต่างกัน เช่น เนื้อเยื่อใบ มักใช้เอ็นไซม์เซลลูเลสและเพกทิเนสในการแยกโพรโทพลาสต์
วิธีนี้เอ็นไซม์ย่อยผนังเซลล์เพื่อให้โพรโทพลาสต์หลุดออกมา เอ็นไซม์ที่ย่อยผนังเซลล์เรียกว่า ไฮโดรไลติกเอ็นไซม์ (hydrolytic enzyme) เนื่องจากองค์ประกอบของผนังเซลล์ได้แก่ เซลลูโลส เฮมิเซลลูโลส และชั้นระหว่างเซลล์ คือ มิดเดิลลาเมลลา (middle lamella) นั้นมีกรดเพกติก จึงใช้เอ็นไซม์พวกเซลลูเลส เฮมิเซลลูเลสและเพกทิเนสรวมกัน
เอ็นไซม์เหล่านี้ส่วนมากได้จากเชื้อรา ปัจจุบันมีการผลิตเซลลูเลสที่ได้จากราทำเป็นอุตสาหกรรม โดยมีชื่อทางการค้าต่างกัน เช่น Cellulase Onozuka, Meicelase P และ Driselase นอกจากเอ็นไซม์ดังกล่าวแล้ว ยังมีเอ็นไซม์ชนิดอื่นอีก ซึ่งมักใช้กับเนื้อเยื่อที่ย่อยยาก เช่น เฮลิเคส (Helicase) ได้มาจากหอย มักใช้ร่วมกับมาเซอเรสและเซลลูเลส ในย่อยมันฝรั่ง โคโลเนส (Colonase) เป็นเพกทิเนสที่มีฤทธิ์ ใช้ร่วมกับเซลลูไลซิน (Cellulysin) ในย่อยแคลลัสของข้าว กลูซูเลส (Glusulase) ย่อยโพรโทพลาสต์ของยีสต์ อาจใช้ร่วมกับเซลลูไลซินในการย่อยโพรโทพลาสต์ของเนื้อเยื่อ aleurone ของข้าวบาร์เลย์ ไซโมเลส (Zymolase) ใช้ย่อยละอองเรณูในระยะชุดสี่เอ็นไซม์เหล่านี้ใช้กับเนื้อเยื่อที่ย่อยยาก ไม่จำเป็นที่จะต้องนำมาใช้กับเซลล์มีโซฟิลล์ของใบหรือเซลล์แขวนลอย
เอ็นไซม์ที่ดีควรมีแอคทิวิตีจำเพาะเจาะจงและมีความบริสุทธิ์ให้มาก หากมีสิ่งเจือปนจะทำให้แยกโพรโทพลาสต์ไม่ได้ผล แต่บางคนแย้งว่าถ้าเอ็นไซม์มีความบริสุทธิ์มากเกินไปอาจทำให้โพรโทพลาสต์ตายได้ควรมีสิ่งเจือปนบ้าง ข้อสำคัญที่ควรระวัง คือ เวลาและชนิดของเอ็นไซม์ที่ใช้ต้องให้เหมาะสมกับเซลล์พืชที่จะแยกโพรโทพลาสต์ออกมา

การแยกโพรโทพลาสต์โดยใช้เอ็นไซม์ทำได้ 2 วิธี คือ

1. วิธีใช้เอ็นไซม์เป็นขั้นตอน (sequential method)
วิธีนี้เป็นการทำ 2 ขั้นตอน เช่น นำใบมาลอกเอาเอพิเดอร์มิสออก ในกรณีที่ลอกเอา เอพิเดอร์มิสออกไม่ได้ เช่น ใบของหน่อไม้ฝรั่ง ให้ใช้วิธีบดโดยเครื่องโฮโมจีไนเชอร์ แล้วนำไปแช่ในสารละลายเอ็นไซม์เพกทิเนส เขย่าเล็กน้อยในระยะเวลาหนึ่ง เพื่อแยกเซลล์ให้หลุดออกจากกันแล้วนำเซลล์เหล่านี้ไปย่อยเอาผนังเซลล์ออก โดยใช้สารละลายเอ็นไซม์เซลลูเลส
แรงลอยตัว (buoyancy) ของโพรโทพลาสต์ที่แยกออกมา ทำให้สามารถแยก โพรโทพลาสต์ออกจกาเอ็นไซม์และเศษของเซลล์ ถ้าใช้น้ำตาลแมนนิทอลหรือซอร์บิทอลเป็นตัวปรับความแรงดัน โพรโทพลาสต์ที่ได้มักจมอยู่ที่ก้นหลอดภายหลังจากการหมุนเหวี่ยง (centrifuge) ด้วยความเร็วต่ำ ทำให้สามารถดูดสารละลายเอ็นไซม์และเศษเซลล์เล็กน้อยทิ้งไปได้ ล้างโพรโทพลาสต์ที่จมอยู้ก้นหลอดโดยการทำให้กระจายออกจากก้นด้วยสารละลายที่มี น้ำตาลซูโครสเป็ตัวปรับความแรงดัน จากนั้นหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำอีกครั้ง โพรโทพลาสต์จะลอยใกล้ ๆ ผิวของสารละลาย พวกเศษเซลล์ที่ยังย่อยไม่หมดจะตกตะกอน ใช้ปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วดูดโพรโทพลาต์ออกมาใส่ในสารละลายแมนนิทอลหรือซูโครส แล้วนำไปปั่นอีกครั้ง โพรโทพลาสต์ที่ได้จากการล้างครั้งนี้สามารถนำไปใช้สำหรับการทดลองต่าง ๆ ได้
วิธีนี้เหมาะกับเนื้อเยื่อมีโซฟิลล์ของใบบางชนิด เช่น ใบยาสูบ แต่พืชบางชนิดระหว่างแช่ใบในเอ็นไซม์เพกทิเนสพร้อมเขย่าเบา ๆ อาจทำให้โพรโทพลาสต์แตกในขณะที่ยังอยู่ภายในผนังเซลล์ วิธีแก้โดยเอาด้านที่ลอกเอพิเดอร์มิสของใบออกให้สัมผัสกับเอ็นไซม์เพ กทิเนสโดยไม่ต้องเขย่า จากนั้นนำไปแช่ในเอ็นไซม์เซลลูเลสโดยไม่ต้องเขย่าเช่นกัน รอสักพักใหญ่จึงเขย่าเบา ๆ โพรโทพลาสต์จะหลุดออกมาแต่โพรโทพลาสต์ที่ได้ออกมาโดยวิธีนี้มีจำนวนน้อย กว่าวิธีที่แช่ เอ็นไซม์เพกทิเนสแล้วเขย่า
2. วิธีใช้เอ็นไซม์ผสม (mixed enzyme method)
วิธีนี้เป็นการทำเพียง 1 ขั้นตอน โดยใช้เอ็นไซม์เซลลูเลสและเพกทิเนสผสมกัน ทำให้เกิดการแยกเซลล์และทำลายผนังเซลล์ในเวลาเดียวกัน พบว่า การแยกโพรโทพลาสต์จากเซลล์มีโซฟีลล์จากใบพืช อาจมีโพรโทพลาสต์ของเอพิเดอร์มิสชั้นบนติดมาในระหว่างที่ใช้เอ็นไซม์ผสมนี้ สามารถแยกโพรโทพลาสต์จากเซลล์มีโซฟีลล์และเอพิเดอร์มิสได้โดยอาศัยแรงลอยตัว ซึ่งมีความแตกต่างกัน เมื่อหมุนเหวี่ยงในแมนนิทอลหรือซอร์บิทอลจะพบโพรโทพลาสต์จากมี โซฟีลล์สีเขียวสดตกตะกอนที่ก้นหลอด โดยทั่วไปเอพิเดอร์มิสชั้นล่างมักไม่ให้โพรโทพลาสต์ออกมา เพราะถูกดึงออกแต่แรกแล้ว ถึงมีก็จำนวนน้อย สิ่งที่เหลือจากการย่อยคือ คิวทิเคิล และเซลล์คุม (guard cell) ซึ่งผนังเซลล์คุมแข็งแรงและสามารถทนต่อการทำลายของเอ็นไซม์

ชิ้นส่วนพืชที่ใช้แยกโพรโทพลาส

การแยกโพรโทพลาสจากเนื้อเยื่อของพืชนั้น ไม่นิยมแยกจากเซลล์ที่มีการเจริญเติบโตขั้นที่สอง (secondary growth) เนื่องจากเซลล์เหล่านี้มีผนังเซลล์ที่หนาเพราะมี secondary wall ที่มักประกอบด้วยสารพวกลิกนิน (lignin) ซูเบอริน (suberin) และคิวติน (cutin) ซึ่งย่อยได้ยาก เซลล์เหล่านี้พบในต้นพืชที่ส่วนใหญ่ไม่มีชีวิตแล้ว หรือถ้ายังมีชีวิตอยู่จะพบในเนื้อเยื่อที่ไม่มี การตื่นตัว (inactive) สำหรับเนื้อเยื่อที่เหมาะต่อการใช้แยกโพรโทพลาสได้แก่ แผ่นใบ ใบเลี้ยง เอ็นโดสเปอร์ม และแคลลัส เป็นต้น ตัวอย่างชิ้นส่วนของพืช ส่วนผสมของเอ็นไซม์ที่ ใช้ย่อยผนังเซลล์ แสดงดังตารางที่ 15

ข้อควรพิจารณา

1. การเจริญเติบโต อายุของพืช และระยะการพัฒนาของพืชที่นำมาใช้มี ผลอย่างมากต่อปริมาณและความมีชีวิตของโพรโทพลาสที่แยกได้ ตัวอย่าง สภาพต้นพิทูเนีย (Pitunia parodii) ที่เหมาะคือ การปลูกโดยเพาะเมล็ดในที่มีแสง ในดินที่เหมาะสมที่อุณหภูมิ 20 - 23 ๐ซ แล้วย้ายต้นอ่อนไปไว้ในเรือนเพาะชำที่ 20 - 25 ๐ซ ให้ได้รับแสง 10,000 ลักซ์ ช่วงแสงนาน 16 ชั่วโมง ก่อนย้ายไปปลูกในกะบะจนมีลำต้นสูงประมาณ 8 - 10 เซนติเมตร หรือมีใบที่คลี่เต็มที่ 7 - 10 ใบ จึงนำใบมาใช้แยกเอาโพรโทพลาสต้องไม่ปล่อยให้ต้นมีการพัฒนาจนถึงระยะสร้าง ตาดอก
2. การควบคุมศัตรูพืช โดยเฉพาะเชื้อโรคที่อาจปนเปื้อนเช่น แบคทีเรีย ซึ่งอาจเกิดจากการที่ใบได้รับอันตรายจากแมลงหวี่ขาว (white fly) และแมงมุงแดง (red spider mite) โดยการฉีดพ่นหรือรมด้วย DDT/Lindane หรือ propoxur และ nicotine
3. แคลลัสและเซลล์แขวนลอย สามารถนำมาแยกเอาโพรโทพลาสได้ดี และควรอยู่ในระยะที่เซลล์มีการเจริญเป็นแบบ exponential phase ในระยะนี้เซลล์จะมีผนังเซลล์ที่ ค่อนข้างบาง มีลักษณะที่เรียกว่า cellulosic จึงต้องการช่วงเวลาในการย่อยด้วยเอ็มไซม์ cellulase/pectinase ที่ค่อนข้างสั้น

ขั้นตอนวิธีการ (protocols) ในการแยกโพรโทพลาสโดยใช้เอ็นไซม์

โดยทั่ว ๆ ไป การแยกโพรโทพลาสของเนื้อเยื่อพืชมีขั้นตอนวิธีการดังนี้
1. นำเนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนพืชมาทำความสะอาดและฟอกฆ่าเชื้อด้วยคลอรอกซ์ 10 % นาน 10 - 15 นาที
2. ล้างคลอรอกซ์ออกให้หมดด้วยน้ำกลั่นที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 2 - 3 ครั้ง
3. ตัดเนื้อเยื่อเป็นชิ้นเล็ก ๆ ขนาด 5 x 5 หรือ 5 x 10 มม. แล้วแช่ในสารละลายที่มีส่วนผสมของเอ็มไซม์ดังนี้
Potassium buffer หรือ citrate buffer ที่ pH 5.5
Pectinase 0.5 - 1.0 %
Cellulase 1 - 4 %
D-mannitol 0.5 - 0.7 M
4. ให้เอ็นไซม์ย่อยผนังเซลล์นาน 2 - 24 ชั่วโมง ที่ 25 ๐ซ ขึ้นกับชนิดของพืชและชิ้นส่วนพืช นำสารละลายที่ย่อยได้ไปกรองผ่านตะแกรงที่มีรูขนาด 100 - 500 mm แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 100 g นาน 2 - 3 นาที ก่อนดูดเอาของเหลวที่แยกตัวด้านบนออกทิ้งให้เหลือเฉพาะโพรโทพลาสต์

โดย Gamborg et al. (1981) ได้เสนอวิธีการแยกโพรโตพลาสต์ของพืชทั่ว ๆ ไปไว้ดังนี้
1. แยกเอาชิ้นส่วนของพืช (เช่น ใบ ใบเลี้ยง) ที่ต้องการโพรโทพลาสต์ มาทำความสะอาดและฟอกฆ่าเชื้อ
2. ลอกเอาชั้น epidermis ออก จากนั้นตัดชิ้นส่วนพืชให้ได้ขนาดตามต้องการ นำไปใส่ในจานแก้ว ที่มีส่วนผสมของเอ็มไซม์ดังนี้ ปรับ pH = 5.8
Onozuka R10 hemicellulase 1 - 4 %
Rhozyme HP 150, 1 - 4 %
Pectinase 0.5 - 1.0 %
3. คอบจานแล้วด้วยแผ่น paraffin แล้วนำไปไว้ที่ 22 - 24 ๐ซ นาน 4 - 16 ชั่วโมง บนเครื่องเขย่า
4. ตรวจสอบโพรโทพลาสต์ที่หลุดออกมาจากผนังเซลล์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ใช้ปิเปตดูดสารละลายไปกรองผ่านตะแกรงขนาด 60 - 80 mm นำไปปั่นที่ความเร็ว 50 g นาน 6 นาที แล้วล้างโพรโทพลาสต์ด้วยสารละลาย PS-3 ประมาณ 2 - 3 ครั้ง
หมายเหตุ
กรณีการแยกโพรโทพลาสต์จากเซลล์แขวนลอย ทำได้โดยรวมเซลล์แขวนลอยและส่วนผสมของเอ็มไซม์ดังกล่าวข้างต้นในปริมาตรเท่า ๆ กัน

เนื้อเยื่อพืชเมื่อถูกย่อยด้วยเอ็มไซม์ pectinase เซลล์จะแยกออกจากกันเป็นเซลล์เดี่ยว ๆ ที่ยังคงมีผนังเซลล์หุ้มอยู่ทำให้เซลล์ยังคงมีรูปร่างเหมือนเดิมและไม่ สม่ำเสมอ แต่เมื่อย่อยด้วยเอ็มไซม์ cellulase และเอ็มไซม์อื่น ๆ แล้ว จะเหลือเพียงเซลล์เมมเบรนห่อหุ้มเท่านั้นทำให้เซลล์มีลักษณะกลมเหมือนกันหมด อย่างไรก็ตาม ความสำเร็จของการแยกโพรโทพลาสต์ขึ้นกับปัจจัยหลายอย่าง เช่น ชนิดของเนื้อเยื่อ (ใบ ใบเลี้ยง ราก เซลล์แขวนลอย หรือแคลลัส) ชนิดของพืช (สปีชีย์) และพันธุ์พืช ชนิดและส่วนผสมของเอ็มไซม์ที่ใช้ ตลอดจนระยะการพัฒนาของพืชดังได้กล่าวมาแล้ว จึงจำเป็นต้องตรวจสอบความมีชีวิตและความสามารถของ โพรโทพลาสต์ ทั้งในช่วงหลังจากการแยกและหลังการจัดการต่าง ๆ นอกจากนี้แล้วเทคนิคและ ขั้นตอนวิธีการต่าง ๆ ที่ใช้สำหรับพืชแต่ละชนิดนั้น มีรายละเอียดแตกต่างกัน

วิธีการรวมโพรโทพลาสต์

การรวมโพรโทพลาสต์ (Protoplast fusion หรือ somatic hybridization) เป็นการผสมพันธุ์พืชวิธีหนึ่งซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งกรณีที่การผสมพันธุ์โดยใช้เพศไม่อาจทำได้ (เกิด sexual incompatibility) เนื่องจากการรวมโพรโทพลาสต์สามารถทำได้โดยตรงโดยไม่มี สิ่งขวางกั้น โดยมีข้อแม้ว่าการแยก เพาะเลี้ยงและชักนำให้โพรโทพลาสต์นั้นให้เกิดเป็นต้นที่สมบูรณ์สามารถกระทำได้ หลังการรวมโพรโทพลาสต์แล้วเซลล์ที่ได้ เรียกว่า heterokaryons จะประกอบด้วยนิวเคลียสของพืชทั้ง 2 ชนิด (สปีชีย์) อยู่ภายในไซโตพลาสซึมเดียวกัน แล้วสร้างผนังเซลล์ใหม่มาห่อหุ้มก่อนที่จะเกิดการแบ่งเซลลื การรวมนิวเคลียสเข้าด้วยกันนี้เป็นผลให้เกิดเซลล์ลูกผสม (somatic hybrid cell) และพัฒนาเป็นต้นที่สมบูรณ์ผ่านกระบวนการ embryogenesis และ/หรือ organogenesis ได้เช่นเดียวกับเซลล์ปกติที่เพาะเลี้ยง
อย่างไรก็ตามต้นที่ได้ลักษณะที่เป็นลูกผสม (hybrid plants) ดังนั้นการรวม โพรโทพลาสต์จึงไม่เพียงแต่เปิดโอกาสให้สามารถผสมพันธุ์ระหว่างพืชต่างชนิดหรือต่างสกุล ซึ่งไม่สามารถกระทำได้ง่ายโดยวิธีผสมพันธุ์แบบปกติ ยังเปิดโอกาสให้มีการเปลี่ยนแปลง ทางพันธุกรรมในพืชที่ขยายพันธุ์โดยส่วนทางด้านลำต้น ในพืชที่เกสรผู้เป็นหมัน (sterile species) หรือพืชที่เกสรผู้กึ่งเป็นหมัน (subfertile species) และในพืชที่มีอายุยาวนาน
วิธีการรวมโพรโทพลาสต์มีด้วยกันหลายวิธี แตกต่างกันไปในส่วนขององค์ประกอบของสารชักนำการรวมตัว ที่เรียกว่า fusogen และจำเป็นต้องตรวจสอบการรวมตัวของ โพรโทพลาสต์โดยใช้ลักษณะที่มองเห็นได้ด้วยตา (visual markers) เช่น กรณีโพรโทพลาสต์จากมีโซฟิลล์ของพืชชนิดหนึ่งที่มีสีเขียวเมื่อรวมกับโพรโทพลาสต์ที่ไม่มีสี เช่น ที่ได้จากการเลี้ยงและแยกจากเซลล์ของราก ใบเลี้ยง เซลล์ heterokaryons จำแนกได้จากการที่โพรโทพลาสต์ทั้งหมดจะมีการสร้างคอลโรพลาสเช่นเดียวกับที่ได้จากเซลล์แม่ที่มาจากมีโซฟิลล์ และ มีไซโตพลาสซึม จำนวนมากจากเซลล์พ่อที่ไม่ใช่เซลล์มีโซฟิลล์
โพรโทพลาสต์ที่เพาะเลี้ยงด้วยกันมีโอกาสเกิดการละลายของเยื่อหุ้มเซลล์ ทำให้ไซโทพลาสต์ซึมไหลไปรวมกัน กลายเป็นโพรโทพลาสต์ที่มีขนาดใหญ่และมีนิวเคลียสสองอันหรือมากกว่าสองขึ้นไป

การรวมกันของโพรโทพลาสต์เกิดได้ 2 แบบ คือ
1. การรวมกันที่เกิดขึ้นเอง (Spontaneous fusion)
เป็นการรวมกันของโพรโทพลาสต์ที่เกิดขึ้นเอง กล่าวคือ ในระหว่างที่ใช้เอ็นไซม์ย่อยผนังเซลล์ พลาสโมเดสมาตาเกิดการขยายขนาดเนื่องจากไม่มีผนังเซลล์ควบคุม ทำให้เกิดการไหลของไซโทพลาสซึมและออร์แกเนลล์ต่าง ๆ ในระหว่างโพรโทพลาสต์ที่เกาะติดกัน โอกาสเกิด การรวมกันแบบนี้มีน้อย คือ ไม่เกิน 0.1 % ของโพรโทพลาสต์ทั้งหมด หรือบางครั้งในระหว่าง การปฏิสนธิหลอดละอองเรณูรวมกับถุงเอ็มบริโอ ทำให้เกิดการรวมกันของโพรโทพลาสต์ได้ ในกรณีอย่างนี้จัดว่าเป็น spontaneous fusion อีกแบบหนึ่ง ดังนั้นคำว่า spontaneous fusion หมายถึง การรวมกันของโพรโทพลาสต์ที่เกิดเองโดยมิได้เกิดจากการชักนำ
2. การชักนำให้เกิดการรวมกัน (Induced fusion)
เมื่อเลี้ยงโพรโทพลาสต์ในที่มีสภาพที่มีแรงดันออสโมซิส แต่ละโพรโทพลาสต์จะ กระจายไปทั่ว ถ้าต้องการให้แต่ละโพรโทพลาสต์ติดกันตรงผิวเนื้อเยื่อหุ้มเซลล์ต้องใส่สารบางอย่างลงไป เช่น โซเดียมไนเตรต สารละลายพอลิเอทธิลีนไกลคอล หรือใส่โพรโทพลาสต์ลงใน บัฟเฟอร์ของไกลซีน และโซเดียมไฮดรอกไซด์ที่มีแคลเซียมเป็นตัวทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ที่ความอยู่ตัว เมื่อเยื่อหุ้มเซลล์ติดกันโอกาสที่เยื่อหุ้มเซลล์จะรวมกันก็มีได้ ทำให้เกิดการรวมกันของ ไซโทพลาสซึมได้โพรโทพลาสต์ใหม่ลักษณะกลม
การรวมกันของโพรโทพลาสต์อาจเกิดจากสองโพรโทพลาสต์หรือมากกว่า ทำให้ได้หลายนิวเคลียสในโพรโทพลาสต์ที่เกิดใหม่ แต่ในขณะเดี่ยวกันบางโพรโทพลาสต์อาจไม่รวมกันก็ได้ การรวมกันของโพรโทพลาสต์ไม่จำเป็นต้องมาจากเซลล์ชนิดเดียวกัน เช่น โพรโทพลาสต์ของใบรวมกับโพรโทพลาสต์ของแคลลัสในพืชสกุลหรือชนิดเดียวกันหรือต่างกันก็ได้ เมื่อรวมกันแล้ว ถ้าต่างกันเรียกว่า เฮเทอโรแคริออน (heterkaryon) เฮเทอโรแคริออนมีประโยชน์มากกว่า โฮโมแคริออน เพราะเกิดการสร้างลูกผสมจากเซลล์ร่างกาย (somatic cell hyibridization) มีประโยชน์ในการได้พืชพันธุ์ใหม่ขึ้นมา ซึ่งตามธรรมชาติแล้วผสมไม่ได้

วิธีกระตุ้นการรวมของโพรโทพลาสต์ ดังนี้

1. การรวมโพรโทพลาสต์โดยวิธีปกติ มีขั้นตอนวิธีการดังนี้
ง นำโพรโทพลาสต์ที่แยกได้จากพืชทั้ง 2 ชนิด เช่น การรวมโพรโทพลาสต์ของ Petunia parodii และ P. albino มาปรับให้มีความหนาแน่นของเซลล์ประมาณ 2 x 105 เซลล์/มล. ในสารละลายอาหาร M/SP19M
เทใส่หลอดปั่นเหวี่ยง หลอดละ 4 และ 8 มล. พันธุ์ละ 7 หลอด ดังนี้
1 หลอด 4 มล. P. parodii เขียนปิดหลอด : P. par. viability
1 หลอด 4 มล. P. hybrida เขียนปิดหลอด : P. hyb. viability
1 หลอด 8 มล. P. parodii เขียนปิดหลอด : P. par. selfed
1 หลอด 8 มล. P. hybrida เขียนปิดหลอด : P. hyb. selfed
3 หลอด 4 มล. P. parodii + เขียนปิดหลอด : Fusion
4 มล. P. hybrida เขียนปิดหลอด :
นำทุกหลอดยกเว้น 2 หลอดที่เป็น viability control ไปปั่นด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยง แล้วแยกเอกอาหารออกทิ้ง
เติมสารกระตุ้นการรวมตัว ประมาณ 2 มล. นาน 10 นาที แล้วล้างโพรโทพลาสต์ที่ได้จนปราศจากสารกระตุ้นการรวมตัว
นำไปเลี้ยงในอาหาร M/SP ปริมาตร 16 มล.
ขณะเดียวกันเตรียมจานแก้วขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 9 ซม. ที่เติมอาหารวุ้น M/SP1 9M ดังนี้
P. parodii viability 8 มล./จาน 1 จาน
albino P. hybrida viability 8 มล./จาน 1 จาน
3 หลอดที่รวมกัน แต่ละหลอดใส่ใน 2 จาน 8 มล./จาน 6 จาน
P. parodii selfed 8 มล./จาน 1 จาน
albino P. hybrida viability 8 มล./จาน 1 จาน
นำหลอดที่เหลือของ selfed ทั้ง 2 หลอด 8 มล./จาน 2 จาน (post fusion control)
ปิดครอบแต่ละจานด้วยพาราฟิน เก็บไว้ที่ 25 ๐ซ ในที่มีแสง 700 ลักซ์
ส่วนประกอบของสารกระตุ้นการรวมตัว และสารล้าง (washing solution)
ชนิด ส่วนประกอบ
Fusion solutions
PEG 30 % (w/v) polyethylene glycol, mol.wt. 6,000 + 4 % (w/v) sucrose + 0.01 M CaCl2.2H2O (นึ่งแล้วเก็บไว้ที่มืดที่ 4 ๐ซ)
High pH/Ca2+ 0.05 M glycine-NaOH buffer + 1.1 % (w/v) CaCl2.6H2O + 9 % (w/v) mannitol (ปรับ pH 10.4 กรองเชื้อโรคก่อนใช้)
High pH/Ca2+ ใช้กรณี pH สูง/ water fusion เตรียมเช่นเดียวกัน แต่ใช้ 10 % (w/v) mannitol
Washing solution
CPW 13M/Ca2+ เช่นเดียวกับการเตรียม CPW 13M แต่เติม 0.74 ./ 100 มล. CaCl2.2H2O
Fusion and washing solutions กรณีการรวมโพรโทพลาสต์จำนวนน้อย
Fusion solution
PEG 22.5 % (w/v) polyethylene glycol, mol.wt. 6,000 + 1.8 % (w/v) sucrose + 1.54 มก./ 100 มล. CaCl2.2H2O + 9.52 มก./ 100 มล. KH2PO4 + 11 % (w/v) sucrose
Washing solution 740 มก./ 100 มล. CaCl2.2H2O + 375 มก./ 100 มล. glycine + 11 % (w/v) sucrose (ปรับ pH 5.8)

2. การรวมโพรโทพลาสต์โดยใช้สาร Polyethylene Glycol (PEG)
ง นำโพรโทพลาสต์ที่แยกได้จากพืชทั้ง 2 ชนิด ปรับให้มีความหนาแน่นของเซลล์ประมาณ 2 x 105 เซลล์/มล. ในสารละลายอาหาร M/SP 19 M
ง นำโพรโทพลาสต์ที่แยกได้จากพืชทั้ง 2 ชนิด อย่างละ 4 มล. มารวมกันในหลอดแล้วเติมสารละลาย PEG 2 มล. นาน 10 นาที แล้วเจือจาง PEG ทุก ๆ 5 นาที โดยดูดสารออกแล้วเติมอาหารแทน
ง นำโพรโทพลาสต์ที่ได้ไปปั่นที่ความเร็ว 100 g เป็นเวลา 10 นาที เพื่อแยกเอา โพรโทพลาสต์ที่รวมตัวกันและลอยอยู่ส่วนบนไปเพาะเลี้ยง

3. การรวมโพรโทพลาสต์โดยใช้ High ph/Ca2+
นำโพรโทพลาสต์ที่แยกได้จากพืชทั้ง 2 ชนิด ความหนาแน่นของเซลล์ประมาณ 2 x 105 เซลล์/มล. อย่างละ 4 มล. มารวมกันแล้วเติมสารละลาย high pH/Ca2+ บ่มไว้ที่ 30 ๐ซ นาน 10 นาที
ปั่นที่ความเร็ว 50 g เป็นเวลา 3 - 4 นาที แล้วล้างด้วย washing solution ก่อนนำไปเลี้ยง

4. การรวมโพรโทพลาสต์โดยใช้ High ph/Ca2+ ร่วมกับ PEG
นำโพรโทพลาสต์ที่แยกได้จากพืชทั้ง 2 ชนิด ความหนาแน่นของเซลล์ประมาณ 105 - 106 เซลล์/มล. อย่างละ 4 มล. มารวมกันแล้วเติมสารละลาย PEG ที่มีส่วนประกอบดังนี้
- PEG 150 33 %
- CaCl2. 2H2O 20 mM
- KH2PO4 0.7 mM
- Glucose 0.2 M (ปรับ pH 10.5)
หยดสารละลาย PEG ลงในจานแก้ว แล้วหยดโพรโทพลาสต์ทั้ง 2 ชนิดรวมกันลงรอบ ๆ หยดของสารละลาย PEG ทิ้งไว้นาน 10 นาที
ค่อย ๆ ผสมโพรโทพลาสต์กับสารละลาย PEG แล้วเติมด้วยสารละลาย resupension ปริมาตร 30 มล. นาน 30 - 50 นาที สารละลาย resuspension ประกอบด้วย
- CaCl2 100 mM
- Mannitol 0.4 M (ปรับ pH 10.5)
ล้างโพรโทพลาสต์ด้วย washing solution 3 ครั้ง ปั่นที่ความเร็ว 800 รอบ/นาที นาน 3 นาที ก่อนนำไปเลี้ยง

5. การรวมโพรโทพลาสต์โดยกระตุ้นด้วยไฟฟ้า
ได้มีการใช้เทคนิคที่ใช้กระแสไฟฟ้า มาทำให้เกิดรวมกันระหว่างแวคิลโอลกับ โพรโทพลาสต์ ซึ่งโพรโทพลาสต์จากใบที่มีสีเขียวและไม่มีสี (etiolated) และระหว่าง โพรโทพลาสต์ที่มีหน้าทางสรีรวิทยาต่าง ๆ กัน หลักการฟิวชันโดยใช้กระแสไฟฟ้ามาจากทฤษฎีของไดอิเล็กโทรโฟรซิส (dielectrophoresis) ของอนุภาคที่เป็นกลางทางไฟฟ้า กล่าวคือ ไดอิเล็กโทรโฟรีซิสเป็นการเคลื่อนที่ของอนุภาคที่เป็นกลางทางไฟฟ้าภายใต้ ทั้งสนามไฟฟ้า ภายนอกที่ไม่สม่ำเสมอ เหนี่ยวนำให้เกิดการโพลาไรซ์ (polarize) ภายในอนุภาค ซึ่งเกิดได้ทั้งสนามไฟฟ้ากระแสสลับและไฟฟ้ากระแสตรง จากทฤษฎีดังกล่าว เมื่อนำมาใช้กับเซลล์หรือ โพรโทพลาสต์ ซึ่งถือว่าเป็นวัสดุไดอิเล็กทริกแขวนลอยในสารละลายที่มีค่าสภาพนำไฟฟ้าต่ำ สาเหตุที่เซลล์หรือโพรโทพลาสต์ตอบสนองต่อสนามไฟฟ้า เนื่องจากส่วนประกอบภายในเป็นน้ำ โปรตีน ดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ ซึ่งสารพวกนี้มีสภาพความเป็นขั้นทางไฟฟ้า เมื่ออยู่ในสนามไฟฟ้าจะเกิดการโพลาไลซ์ได้ดี นอกจากนี้เยื่อหุ้มเซลล์ยังประกอบด้วยชั้นของฟอสโฟลิพิดที่จะแสดงอำนาจขั้น ทางไฟฟ้า เมื่อเหนี่ยวนำด้วยสนามไฟฟ้าที่ไม่สม่ำเสมอจะเกิดการโพลาไลซ์ของประจุภายใน เซลล์หรือโพรโทพลาสต์ หรือเรียกว่า เกิดไดโพลโมเมนต์ (dipole moment) ไดโพลโมเมนต์มีอันตรกิริยากับสนามไฟฟ้าภายนอก เกิดแรงสุทธิดึงเซลล์หรือโพรโทพลาสต์ให้เคลื่อนที่ เรียกแรงนี้ว่า ไดอเล็กโทรโฟรีติก (dielectrophoretic force) ถ้าหากมีอนุภาคที่เป็นกลางไฟฟ้ามากกว่า 1 อนุภาคภายใต้สนามไฟฟ้าที่ไม่สม่ำเสมอ ผลจากการเกิดโพลาไรซ์ ทำให้อนุภาคดึงดูดอนุภาคที่มีขึ้นต่างกันเข้าหากันกลายเป็นโซ่เซลล์ (pearl chain) มีขั้นตอนดังนี้
1) ใช้สนามไฟฟ้ากระตุ้นให้โพรโทพลาสต์มาเรียงตัวชิดในแนวเดียวกัน (โดยใช้ความต่างศักยไฟฟ้าระหว่าง 1 - 10 KV/cm ทั้งนี้ขึ้นกับความหนาแน่นของโพรโทพลาสต์ที่ใช้ และความสามารถในการนำไฟฟ้าของอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยง
2) ยิงกระแสอนุภาคอิเลคตรอน ให้ผ่านทะลุโพรโทพลาสต์ที่เรียงตัวชิดในแนวเดียวกัน ซึ่งจะทำให้เซลล์เมมเบรนของโพรโทพลาสต์ฉีกขาด และโพรโทพลาสต์ไหลเข้าไปรวมกันได้ เมื่อเซลล์เมมเบรนมีการเชื่อมติดกันใหม่จะเกิดเป็นโพรโทพลาสต์ลูกผสมขึ้น (hybrid protoplast)

วิธีการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์

ในสมัยแรกมักเลี้ยงโพรโทพลาสต์ในอาหารเหลว ต่อมามีการดัดแปลง petridish planting technique ของ Bergmann มาใช้ โดยเอาโพรโทพลาสต์ของใบยาสูบรวมกับอาหารแข็งที่มีวุ้น 1.2 % อุณหภูมิ 40 ๐ ซ ผสมให้เข้ากันแล้วเทลงในจานเพาะเชื้อ จากนั้นนำไปอินคิวเบท ทำเหมือนการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย พบว่าโพรโทพลาสต์เจริญได้ดีในที่มืด โพรโทพลาสต์ของใบชอบแสงในปริมาณความเข้มต่ำ ถ้าแสงมากไปสีซีดลงและทำให้โพรโทพลาสต์ตาย ขณะเทโพรโทพลาสต์ที่ผสมอาหารลงในจานเพาะเชื้อ ควบเทบาง ๆ เพื่อไม่ให้โพรโทพลาสต์ขาดออกซิเจน
จุดประสงค์ของการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์เพื่อต้องการให้สร้างผนังเซลล์ขึ้น ใหม่ จากนั้นเซลล์ที่เกิดใหม่เกิดการแบ่งเซลล์ทำให้กลายเป็นกลุ่มเซลล์เพาะเลี้ยง มีการเจริญพัฒนา และในที่สุดกลายเป็นพืชต้นใหม่ขึ้นมาได้ ตราบใดที่โพรโทพลาสต์ยังไม่สร้างผนังเซลล์ในอาหารเพาะเลี้ยงยังต้องการสาร ปรับระดับความดันอยู่ ข้อควรระวัง คือ ออสโมติกโพเทนเชียสของอาหารเพาะเลี้ยงควรเท่ากับเสถียรภาพออสโมติก (osmotic stability) ของโพรโทพลาสต์
ในระหว่างแยกโพรโทพลาสต์ออกมาพบว่าเยื่อหุ้มเซลล์เกิดการรั่ว (leak) ทำให้พวกเกลือและเมตาโบไลต์ต่าง ๆ สูญเสียออกไปจากโพรโทพลาสต์ ซึ่งดูเหมือนว่าเมแทบอไลต์ที่รั่วไหลออกมานี้มีความสำคัญต่อการเพาะ เลี้ยงโพรโทพลาสต์ ดังนั้นจึงต้องเติมองค์ประกอบต่าง ๆ ในอาหารเพาะเลี้ยงให้มากขึ้นและเป็นเหตุผลว่าทำไมอาหารเพาะเลี้ยง โพรโทพลาสต์จึงแตกต่างจากอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์ไปบ้าง
การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์ที่แยกออกมามักเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวหรือกึ่งแข็งกึ่งเหลว ข้อดีของอาหารเหลวคือ สะดวกในการให้ความดันออสโมติกลดลงและง่ายต่อ การย้ายเลี้ยง แต่ข้อเสียคือ ไม่สามารถแยกโคโลนีที่มีมาจากเซลล์เดียวได้ ในขณะที่โพรโทพลาต์ที่ถูกตรึง ในอาหารกึ่งแข็งกึ่งเหลวสามารถให้โคลนของเซลล์ ทำให้การนับ plating efficiency ถูกต้องมากยิ่งขึ้น อย่างไรก็ตามการย้ายเลี้ยงกลุ่มเซลล์โดยวิธีนี้ต้องใช้เวลาในการย้ายทีละกลุ่ม ซึ่งเสียเวลากว่าการย้ายเซลล์ในอาหารเหลว
ถ้าเลี้ยงโพรโทพลาสต์ในอาหารเหลวห้ามเขย่าในระยะแรก เพราะโพรโทพลาสต์ จะแตกควรรอจนกว่าโพรโทพลาสต์สร้างผนังเซลล์ขึ้นมาใหม่จึงเขย่า แล้วเลี้ยงเหมือนเซลล์แขวนลอยการป้องกันไม่ให้โพรโทพลาสต์ขาดออกซิเจนเมื่อ เลี้ยงในอาหารเหลว ทำได้โดยไม่ใส่ปริมาณอาหารเหลวมากเกินไป เช่น ใส่อาหารเหลวปริมาตร 6 มล. ในจานเพาะเชื้อที่มี เส้นผ่าศูนย์กลางขนาด 9 ซม. หรือใช้ hanging drop technique มาเลี้ยงโพรโทพลาสต์

วิธีการเลี้ยงโพรโทพลาสต์ ได้หลายวิธี คือ

การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์มีปัญหาพิเศษเฉพาะตัวหลายอย่าง การพัฒนาวิธีการเพาะเลี้ยงที่มีประสิทธิภาพและได้ผลจึงมีความสำคัญอย่าง ยิ่งในเรื่องที่เกี่ยวกับโพรโทพลาสต์ วิธีที่ใช้เพาะเลี้ยงก็เหมือนกับเรื่องอาหาร ในแง่ที่ว่ามีพื้นฐานเหมือนกับวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์หรือแคลลัส เพียงแต่ว่าการดูแลรักษามีความจำเป็นและมากกว่าการเลี้ยงเซลล์ ทั้งนี้เพราะ โพรโทพลาสต์มีความบอบบางแตกง่ายและต้องย้ายไปยังอาหารใหม่เพื่อปรับระดับ ออสโมติก ซึ่งอาหารใหม่ที่ย้ายโพรโทพลาสต์นี้มีความจำเป็นต่อการเกิดผนังเซลล์ใหม่ และการแบ่งเซลล์
โดยภาพรวมแล้วการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์มักกระทำใน 2 วิธีใหญ่ ๆ คือ การเพาะเลี้ยงในอาหารเหลว และการเพาะเลี้ยงในอาหารแข็ง หรือกึ่งแข็งกึ่งเหลว แต่อาจมี วิธีพิเศษที่นำมาใช้ เช่น ในการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์เดี่ยว ๆ หรือลูกผสมที่เกิดจากการรวมกัน
การเพาะเลี้ยงในอาหารเหลว (culturing in liquid media)
1. แบบ Drop culture หรือ Hanging/Sitting drop culture
โดยเลี้ยงโพรโทพลาสต์ในอาหารให้มีความหนาแน่นประมาณ 5 x 104 มล. แล้วใช้ automatic pipette (เช่น Finnpipette) เพื่อหยดสารแขวนลอยโพรโทพลาสต์ ลงบนฝาด้านในของจานแก้วให้ได้หยดขนาดเล็กประมาณ 20 - 40 ml ปิดฝาจานแก้วแล้วพันทับด้วยแผ่น Nescofilm เพื่อเก็บรักษาความชื้นไว้ภายใน

2. แบบ Microchamber culture
วิธีนี้เหมือนกับ hanging drop technique แต่แทนที่จะใช้จานเลี้ยงเชื้อกลับใช้ แควิตีสไลด์ (cavity silde) หรือไมโครแชมเบอร์ (microchamber) เพื่อความสะดวกต่อการติดตามพัฒนาการของโพรโทพลาสต์แต่ละอัน (ภาพที่ 28)
วิธีการเพาะเลี้ยงทำได้โดยหยดโพรโทพลาสต์ซัสเพนชันลงบนแผ่นปิดสไลด์ที่ ปลอดเชื้อจากนั้นนำแผ่นปิดสไลด์ไปคว่ำลงในแควิตีสไลด์ แล้วทา mineral oil รอบ ๆ แผ่นปิดสไลด์
วิธีการของไมโครแซมเบอร์เหมือนกับแควิตีสไลด์ โดยประกอบด้วยแผ่นสไลด์ 1 แผ่น และแผ่นปิดสไลด์ 3 แผ่น นำแผ่นปิดสไลด์ 2 แผ่น วางทางด้านบนขวาและซ้ายของแผนสไลด์ เว้นที่ตรงกลางไว้เพื่อให้เกิดเป็นไมโครแซมเบอร์ ส่วนแผ่นปิดสไลด์อีก 1 แผ่น หยดโพรโทพลาสต์ซัสเพนชันลงไป วางแผ่นปิดสไลด์ที่หยดโพรโทพลาสต์ซัสเพนชันลงบนสองแผ่นแรก และให้อยู่ภายในไมโครแซมเบอร์ จากนั้นปิดรอบ ๆ แผ่นปิดสไลด์ด้วย mineral oil อากาศผ่านเข้าออกได้ แต่เชื้อต่าง ๆ ผ่านไม่ได้ วิธีนี้สะดวกกว่าแควิตีสไลด์ เพราะความลึกของแซมเบอร์น้อยกว่า

3. แบบ Liquid culture
การเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวจัดว่าเป็นวิธีที่ง่ายและธรรมดาที่สุด โดยเลี้ยง สารแขวนลอยโพรโทพลาสต์ความหนาแน่น 5 x 104 มล. ถึง 10 x 105 เซลล์/มล. ในจานแก้ว ปิดฝาครอบแล้วพันทับด้วยแผ่นพาราฟินเพื่อลดการสูญเสียน้ำของอาหาร ทำให้ได้ผิวบาง ๆ ของ ซัสเพนชันที่มีความลึกประมาณ 1 มิลลิเมตร ซึ่งความลึกขนาดนี้ทำให้ไม่มีปัญหาเกี่ยวกับเรื่องอากาศ นอกจากนี้อาจเลี้ยงในอาหารเหลวที่มีเครื่องค้ำจุนแฟบริก (fabric support) หรือบนกระดาษกรอง วิธีนี้สะดวกต่อการเปลี่ยนอาหารและทำให้โพรโทพลาสต์บางชนิดเติบโตได้ดี ข้อสำคัญอีกประการหนึ่งของการเลี้ยงในอาหารเหลว คือ ทำให้การเปลี่ยนออสโมลาริตีของอาหารค่อยเป็นค่อยไปได้อย่างสะดวก ทำให้เกิดเซลล์ได้เร็วขึ้น

4. แบบ Multiple drop array technique
โดยหยดโพรโทพลาสต์ขนาดประมาณ 40 ml หลาย ๆ หยด ลงบนฝาครอบด้านในของจานแก้ว ปิดฝาครอบแล้วพันทับด้วยแผ่นพาราฟิน วิธีนี้มีประโยชน์ในการทดสอบอาหาร เพาะเลี้ยงชนิดต่าง ๆ โดยใช้โพรโทพลาสต์และจานเพาะเชื้อไม่มากนัก

5. แบบ Microdroplet culture
โดยหยดโพรโทพลาสต์ขนาดเล็ก ๆ ประมาณ 0.25 - 0.5 ml แต่ละหยดให้มีเพียง 1 เซลล์ ลงบนจานแก้วปิดฝาครอบแล้วพันทับด้วยแผ่นพาราฟิน ดังนั้นในแต่ละหยดจะใช้เพียงหนึ่งโพรโทพลาสต์เท่านั้น การใช้วิธีนี้จำเป็นต้องใช้จานเลี้ยงเชื้อชนิดพิเศษที่เรียกว่า Cuprak ซึ่งทำให้สามารถวางแต่ละหยดลงไปในหลุม (well) ที่แยกจากกัน การใช้เทคนิคนี้ควรต้องแน่ใจว่าอาหารเพาะเลี้ยงนั้นเหมาะสมอยู่แล้ว มีประโยชน์ในกรณีที่มีโพรโทพลาสต์จำนวนไม่มากนัก
การเพาะเลี้ยงบนอาหารกึ่งแข็งกึ่งเหลว (culturing on semisolid media)
1. แบบ Agar as gelling agent วิธีนี้ใช้วุ้น (agar)
ที่มีคุณภาพต่าง ๆ กันมาทำให้อาหารแข็งตัวโดยทำให้ความหนาแน่นของ โพรโทพลาสต์ซัสเพนชันเป็น 2 เท่า ของความหนาแน่นที่ต้องการ จากนั้นนำไปผสมกับอาหารแข็งที่อุณหภูมิ 43 - 45 ๐ซ ในปริมาตรที่เท่ากัน ควรเลือกความเข้มข้นของวุ้นที่เมื่อผสมกับ โพรโทพลาสต์ซัสเพนชันแล้วไม่ทำให้อาหารแข็งเกินไป ควรเทวุ้นอาหารที่อุ่นลงไปใน โพรโทพลาสต์ซัสเพนชันซึ่งเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง เทคนิคนี้ดัดแปลงมาจาก Bergmann plating technique ซึ่งใช้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย
การเลี้ยงในอาหารกึ่งแข็ง Semisolid media culture ซึ่งมีได้ 2 แบบ คือ
ง ใช้วุ้น Agar ประมาณ 2 - 4 % เป็นตัวทำให้กึ่งแข็ง โดยหลอมที่ 43 - 45 ๐ ซ แล้วผสมกับโพรโทพลาสต์ที่เลี้ยงอยู่ในอาหารเหลว
ง ใช้ Agarose or alginate ซึ่งได้แก่ agarose, alginate, k-carageen,gelatin และ polyacrylamide แทนการใช้วุ้น
2. Agarose or alginate as gelling agent
สารที่ทำให้อาหารแข็งตัวนอกเหนือจากวุ้น เช่น อัลจิเนต (alginate) ซึ่งพบว่าให้ค่า plating efficiency เหมือนวุ้น จึงมีการศึกษาในเรื่องนี้มากขึ้น ได้แก่ อะกาโรส (agarose) เค-คาแรกจีแนน (K-carrageenan) เจลาทิน (gelatin) และพอลิอะครีลาไมด์ (polyacrylamide) เป็นต้น
พบว่าอะกาโรสให้ผลดีในแง่ของความมีชีวิตและสร้างสารพวก secondary metabolites นอกจากนี้ยังเพิ่มประสิทธิภาพในการเพาะเลี้ยงได้ดีกว่าการใช้วุ้น การที่อะกาโรสให้ผลดีกว่าเนื่องจากมีสารปนเปื้อนที่เป็นพิษน้อยกว่า และที่แตกต่างจากวุ้นอีกอย่างหนึ่งคือ ค่อนข้างเป็นประจุลบกว่า ส่วน Seaplaque agerose เป็นอะกาโรสที่ดัดแปลงทางโครงสร้างเคมีขึ้นมาโดยการเติมกลุ่ม hydroxyethyl เข้าไป การใช้สารที่ทำให้อาหารแข็งตัวซึ่งมีสมบัติดีเหล่านี้นับว่ามีประโยชน์ต่อ พวก recalcitrant protoplast มาก
การเพาะเลี้ยงแบบเทคนิคฟีดเดอร์ชนิดต่าง ๆ (different feeder technique)
1. แบบ Feeder layer
ในการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์บางชนิดจำเป็นต้องลด plaing density ลงให้ต่ำกว่า minimum plating density ทั้งนี้เพราะอาจมีน้อยหรือเป็น mutant หรือ hybrid cells จึงได้มีการคิดเทคนิคแบบ feeder layer ขึ้นมาโดยนำโพรโทพลาสต์ไปฉายรังสีเอกซ์ ซึ่งโพรโทพลาสต์ไม่ตายแต่ไม่มีการแบ่งเซลล์ จากนั้นนำโพรโทพลาสต์ฟีดเดอร์ไปเลี้ยงในอาหารแข็งหรืออาหารเหลวแล้วนำ โพรโทพลาสต์ที่ต้องการเลี้ยงในปริมาณน้อย ๆ มาเทลงบนอาหารแข็งนี้ให้เป็นแผ่นบาง ๆ หรือผสมกับอาหารเหลว
พบว่าชั้นฟีดเดอร์ไม่ขึ้นกับชนิดและได้ผลดีถึงแม้จะมีแผ่นเซลโลเฟนบาง ๆ มากั้นระหว่างกลาง การใช้แผ่นเซลโลเฟนเหนือชั้นฟีดเดอร์ทำให้การย้ายโพรโทพลาสต์ที่เจริญไปยังอาหารใหม่รวดเร็วและสะดวก
2. แบบ Nurse culture
การใช้วิธีนี้เป็นการอาศัยเซลล์พี่เลี้ยงในการทำให้โพรโทพลาสต์ที่ต้องการเพาะเลี้ยงมีการเจริญเติบโตได้ โดยคาดว่ามีการส่งสารบางอย่างจากเซลล์พี่เลี้ยงไปยังโพรโทพลาสต์เป้าหมาย มีประโยชน์ต่อการเลี้ยงลูกผสมที่เกิดจากการรวมกันของโพรโทพลาสต์ โดยใช้แคลลัสเป็นตัวอย่างในการเจริญเติบโตของโพรโทพลาสต์ (nurse tissue) เนื่องจากในระยะแรก โพรโทพลาสต์ยังไม่สามารถผลิตสารที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโต โดยเลี้ยงแคลลัสบนอาหารแข็ง แล้วหยดโพรโทพลาสต์ลงบนกระดาษกรองที่วางทับบนผิวอาหาร
3. แบบ Reservoir media culture
เป็นการใช้จานเลี้ยงเชื้อที่แบ่งออกเป็น 4 ส่วน (quadrant petri dish) แบ่งพื้นที่ในจานแก้วเป็นช่องอาหารส่วนหนึ่งสำหรับเลี้ยงโพรโทพลาสต์ และมีช่องอาหารสำรองไว้อีกส่วนหนึ่ง ซึ่ง 2 ใน 4 ส่วนมีอาหารใหม่เชื่อมติดกับอีก 2 ส่วนที่เหลือที่ใช้เลี้ยงโพรโทพลาสต์ ข้อดีของวิธีนี้ก็คือ ทำให้โพรโทพลาสต์ได้รับอาหารเพิ่มจากสองส่วนที่เก็บอาหารตลอดเวลา เป็นเทคนิคที่มีการดัดแปลงมาจาก plating technique จากการทดลองเมื่อเติมผงคาร์บอนกัมมันต์ (activated charcoal) ลงไปยัง reservoir medium อัตรารอดของโพรโทพลาสต์สูงขึ้น อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้การเกิดสารสีน้ำตาลลดลงด้วย ซึ่งจะมีประโยชน์ต่อการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์ที่มีปัญหาเกี่ยวกับการปล่อย สารสีน้ำตาลออกมา
4. แบบ Agar drop culture
เทคนิคนี้ทำได้โดยการฝัง (embed) โพรโทพลาสต์ลงในหยดอาหารแข็ง จากนั้น นำหยดอาหารที่มีโพรโทพลาสต์ตามความหนาแน่นที่ต้องการไปวางลงในจานเลี้ยง เชื้อ แล้วนำอาหารแข็งอื่นมาราดทับ (overlayered) ล้อมรอบหยดอาหารนี้อีกทีหนึ่ง วิธีนี้ทำให้ เปรียบเทียบอาหารหลายชนิดได้และลดการสูญเสียความชื้น
5. แบบ Filter paper disc on agar media
วิธีนี้เป็นอีกวิธีหนึ่งที่ดัดแปลงมาโดยนำกระดาษกรองไปวางลงบนอาหารแข็ง จากนั้นค่อยเทโพรโทพลาต์ซัสเพนชันลงไปบนกระดาษกรองนั้นอีกทีหนึ่ง กระดาษกรองทำหน้าที่เป็นเครื่องค้ำจุนโพรโทพลาสต์ทำให้การเจริญเป็นไปด้วยดี ในขณะเดียวกันทำให้การย้าย โพรโทพลาสต์ไปยังอาหารใหม่ง่ายและสะดวก นอกจากนี้กระดาษกรองยังเป็นตัวกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนก๊าซและดูดซับสารสี น้ำตาลไปในตัว

ประโยชน์ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์

มีหลายประการ เช่น ใช้ศึกษาออร์แกเนลล์ต่าง ๆ โดยที่ออร์แกเนลล์เหล่านี้ไม่ถูกทำลายเสียสภาพไป ใช้ศึกษาสรีวิทยาของเซลล์ เช่น คุณสมบัติในการลำเลียงของเยื่อหุ้มเซลล์ ตลอดจนการสร้างผนังเซลล์ และประโยชน์ทางด้านปรับปรุงพันธุ์พืช ซึ่งอาจได้พืชพันธุ์ใหม่ขึ้นมา ปัจจุบันสามารถนำเอาโพรโทพลาสต์ของพืชจีนัสเดียวกันแต่ต่างชนิด หรือพืชต่างสับคลาส (subclass) มาทำให้เกิดการรวมกันของโพรโทพลาสต์ คือ ทำให้ผนังเซลล์ละลายแล้วไซโทพลาสซึมและนิวเคลียสไหลไปรวมกันได้เป็น โพรโทพลาสต์ชนิดใหม่จากนั้นทำให้โพรโทพลาสต์นี้กลายเป็นพืชพันธุ์ใหม่ขึ้นมา ตัวอย่างที่ทำสำเร็จแล้ว ได้แก่ ลูกผสมที่ได้จากการรวมโพรโทพลาสต์ของ Nicotiana langsdofii และ N. glauca
เป็นที่คาดหวังว่าการรวมโพรโทพลาสต์ หรือ เทคนิคการรวมสารพันธุกรรม (DNA-recombination) และการถ่ายยีนหรือ ดีเอนเอ (DNA-transfer) จะเป็นแนวทางหนึ่งในการรวมลักษณะที่ต้องการ จากพืชต่างชนิดกันมาก ๆ (diverse species) หรือแม้กระทั่งพืชต่างสกุล เข้าด้วยกัน ซึ่งไม่อาจทำได้ในกรณีการผสมพันธุ์พืชโดยวิธีปกติ หรือโดยวิธีอื่น ๆ ปัจจุบันมี ความพยายามอย่างมากในการรวมโพรโทพลาสต์เพื่อสร้างลูกผสมระหว่างพืชที่มีความแตกต่างทางพันธุกรรมมาก ๆ เพื่อใช้ในกรณีการถ่ายทอดพันธุกรรมความต้านทานหรือทนทานต่อ สภาพที่จำกัด รวมทั้งในการปรับปรุงลักษณะคุณภาพของผลผลิต และการเจริญเติบโตของพืช

1 ความคิดเห็น: